RNáz A: Gyakori kérdések | AG Scientific Blog

Előszó az RNázról

A ribonukleázok (RNázok) a ribonukleinsav (RNS) molekulákat lebontó hidrolitikus enzimek nagy csoportja. Ezek olyan nukleázok, amelyek katalizálják az RNS kisebb összetevőkre történő lebontását. Az RNS lebontását katalizáló enzimek szupercsaládját alkotják, amelyek az átírás és a transzláció szintjén működnek.

3D konformációja a ribonukleáz A enzimnek

Az enzimek minden élő sejtben és biológiai folyadékban jelen vannak, beleértve a prokariótákat és eukariótákat, és számos fontos funkciót látnak el. Az RNázok mindenütt jelen vannak, védtelen környezetben nagyon rövid élettartamúak. A citotoxikus hatások közé tartozik az RNS hasítása, amely a fehérjeszintézis gátlásához és az apoptózis indukciójához vezet. Ezek a citotoxikus hatások előállíthatók az RNáznak a sejt külső felszínére történő alkalmazásával, de azt találták, hogy a citotoxicitás 1000-szeresére nő, ha az enzimet mesterségesen a citoszolba juttatják, ami arra utal, hogy a sejtbe való internalizáció a toxicitás sebességkorlátozó lépése.

Az RNázokat endoribonukleázok és exoribonukleázok közé sorolják. Az endoribonukleázok az A, P, H, I, III, T1, T2, U2, V1, PhyM és V formák.

Az exoribonukleázok közé tartoznak az RNáz PH, II, R, D és T formák, valamint a polinukleotid-foszforiláz (PNPáz), oligoribonukleáz, exoribonukleáz I és exoribonukleáz II formák. Ezek az enzimek különbözőképpen hasítják a különböző RNS-fajokat.

A közelmúltban a kutatók figyelmet fordítottak az RNázokra, mint a rák kezelésének lehetséges hatóanyagaira. Az elképzelés az, hogy olyan enzimet találjanak, amely szelektíven károsítja a rákos sejteket anélkül, hogy a környező normális sejteket érintené.

RNase A termékek az AG Scientific, Inc.

Gyakran ismételt kérdések az RNase A-ról

Mi az RNase A?

A ribonukleáz A a hasnyálmirigy által szekretált emésztőenzim, amely specifikusan “megemészti” vagy hidrolizálja az RNS (de nem a DNS) polimereket a molekulák szomszédos ribonukleotid maradékai közötti kovalens kötéseket alkotó foszfodiészter kötések endonukleáz hasításával.

Mit jelent az “A” az RNase A-ban?

A nevében szereplő “A” nem a szubsztrátspecifikusságára utal, hanem az enzimnek a szarvasmarha hasnyálmirigy által termelt uralkodó formájára. Az RNáz A modifikálatlan, míg az RNáz B, RNáz C és RNáz D glikoformák keverékei.

A nagy mennyiségben és nagy tisztaságban való hozzáférhetősége miatt az RNáz A a fehérjekémia és az enzimológia mérföldkőnek számító munkájának tárgya. Ezenkívül az enzim citotoxikus változatai és homológjai kemoterápiás szerekként bizonyították hasznosságukat.

Mi ennek az enzimnek a története?

Christian Anfinsen segítségével bizonyította, hogy az aminosavak szekvenciája, meghatározza a hajtogatott fehérje szerkezetét, Stanford Moore és William Stein pedig arra használta, hogy kimutassa, hogy az enzimek katalitikus központjában az aminosavak meghatározott elrendezését használják.

A ribonukleáz A volt az első enzim is, amelyet R. Bruce Merrifield szintetizált, megmutatva, hogy a biológiai molekulák egyszerűen kémiai egységek, amelyeket mesterségesen is meg lehet építeni. Mindezek a ribonukleáz segítségével felfedezett központi fogalmak Nobel-díjat kaptak.

Mi az RNáz A szerkezete?

RNáz szerkezete

A 12 600 Da molekulatömegű RNáz A viszonylag kicsi, 124 aminosavból álló szekvenciája négy His-maradékot tartalmaz, a His12 és His119 maradékok közül kettő közvetlenül az enzim katalitikus maradékaként szerepel. A His12 imidazolgyűrűje névtelenül alacsony pK-értékkel rendelkezik (pK < 6,0), ami arra utal, hogy a katalízishez deprotonálni kell. Ezzel szemben a His119 imidazolgyűrűje névtelenül magas pK-értékkel rendelkezik (pK > 6,0), ami arra utal, hogy a katalízishez protonálódnia kell.

A ribonukleáz A egy fehérje?

Az RNáz A egy kis fehérje, az érett enzim mindössze 124 aminosavmaradványt tartalmaz, és nem kapcsolódik hozzá szénhidrát. Más enzimektől eltérően az RNáz A a 20 savból 19-et tartalmaz, csak a triptofán hiányzik belőle.

Mi a hatásmechanizmusa?

His12 általános bázisként működik, elfogadja a szesszilis ribonukleinsavcukorgyűrű 2′-OH protonját. Ez elősegíti a 2′-O nukleofil támadást a pozitívabb töltésű foszfor (P) atomon, ezáltal létrehozva egy 2′-,3′-ciklusos ribonukleotid foszfát intermediert. Ennek az intermediernek a létrejöttét elősegíti a His119 imidazolja, amely általános savként viselkedik, és a protonját az oxigénatomnak adja az érzékeny P-O-R’ kötésben.

A reakció második lépésénél e két His-maradék oldalláncainak általános sav- és bázisaktivitása megfordul. A His12 általános savként viselkedik, újonnan szerzett protont adományozva a 2′-,3′-ciklusos ribonukleotid-foszfát intermediernek, míg a His119, amely általános bázisként viselkedik, protonokat fogad el a vízből, hogy elősegítse ugyanennek a 2′-,3′-ciklusos intermediernek a hidroxil-támadását.

Melyik az RNáz A hasítási helye?

A DNS-készítményekben lévő RNS-szennyeződéseket az RNáz A hatékonyan hidrolizálja a pirimidin-nukleotid (C és U) 3′-foszfátcsoportja és a szomszédos nukleotid 1, 2, 3 5′-ribóza közötti foszfodiészterkötés hasításával. A keletkező köztes 2′-,3′-ciklikus foszfodiészter ezután tovább hidrolizálódik 3′-monofoszfátcsoporttá. A szarvasmarha hasnyálmirigy RNáz A egy 124 aminosavból álló, nagyon stabil fehérje, amelynek legnagyobb mért aktivitása egyszálú RNS-sel szemben van, és a citidinmaradványoknál kétszer gyorsabb a hasítási sebessége, mint az uridilmaradványoknál.

Mi az RNáz A sav/bázis katalízisreakciója?

Az RNáz A is sav/bázis katalízist használ szubsztrátjai kémiai megváltoztatására. Az enzim savas vagy bázikus maradékai protonokat adnak át a reaktánsnak vagy a reaktánsból, hogy stabilizálják a fejlődő töltéseket az átmeneti állapotban. A protonok átadása általában jobb távozó csoportokat hoz létre, ami energetikailag kedvezőbbé teszi a reakciót.

A hisztidin egy nagyon gyakori, a katalízisben részt vevő aminosavmaradék, mivel a hisztidin pKa értéke közel semleges, (pKa=6); ezért a hisztidin fiziológiás pH-n a protonok felvételére és leadására egyaránt képes.

Milyen stabil a Ribonukleáz A?

A Ribonukleáz A elképesztően stabil. Például a tehén hasnyálmirigyből származó ribonukleáz A tisztítására szolgáló egyik eljárás során a kivonatokat kénsavval kezelik, majd szinte forrásig hevítik, és a ribonukleáz A az egyetlen, ami túléli. Ez nem meglepő, mivel a hasnyálmirigy választja ki, és az emésztőrendszer barátságtalan környezetében kell ellátnia feladatát. A ribonukleáz A stabilitása nagyrészt a négy diszulfidkötésnek köszönhető, amelyek a lánc különböző részeit összeragasztják.

A stabilitás megőrzése érdekében általában a terméket az eladó utasításainak megfelelően kell tárolni és kezelni.

Hogyan inaktiválható az RNáz A?

Az RNáz A egy meglehetősen stabil enzim, és 4 diszulfidhidat tartalmaz, amelyek minden emlős hasnyálmirigy ribonukleázban előfordulnak. Amikor a hidak reduktív módon felszakadnak, a fehérje denaturálódik és inaktívvá válik. Reoxidáció hatására a fehérje újra összeáll, és a teljes aktivitás helyreáll. Lehetséges azonban, hogy a hidak csak részben redukálódnak, és az enzimaktivitás megmarad. A karboxilterminuson lévő 4 peptid eltávolítása megsemmisíti az enzimaktivitást.

Mi gátolja az RNáz A-t?

Az uridin-vanadát az RNáz A erős kompetitív inhibitora. Az teszi ilyen erőssé, hogy szerkezete egy átmeneti állapotot utánoz, amely a reakcióban köztes állapot.

Hogyan állítják elő az RNáz A-t törzsből?

Az RNáz A-t általában úgy állítják elő, hogy a törzsanyagot 10 percig forralják, hogy a szennyező DNáz-aktivitást eltávolítsák anélkül, hogy az RNázra hatással lenne. A 65°C-ra történő melegítés nem befolyásolja az RNázokat.

Hogyan kell az elkészített RNáz A törzsanyagot rekonstruálni?

A RNáz A 1-10 mg/ml koncentrációban feloldható 10 mM Tris-HCl, pH 7-ben.5, 15 mM NaCl, a szennyező DNázok inaktiválása érdekében 15 percig 100°C-ra melegítjük, majd lassan szobahőmérsékletre hűtjük, és aliquotokba adagoljuk.

Mi az enzim munkakoncentrációja?

A RNáz A ajánlott munkakoncentrációja 1-100 µg/ml az alkalmazástól függően. Az enzim a reakciókörülmények széles skáláján aktív. Alacsony sókoncentrációban (0 és 100 mM NaCl között) az RNáz A egyszálú és kétszálú RNS-t, valamint az RNS-DNS hibridekben lévő RNS-szálat hasítja.

Milyen tárolási hőmérsékleten és kezelési intézkedésekkel kell tárolni ezt a terméket?

A szorosan lezárt fiolában -20ºC-on tárolja. Felbontás után szilikagél felett vákuumban dehidratálja, mielőtt visszahelyezi -20ºC-ra. A kezelés során óvatosan bánjon vele. Ne használja ezt a vegyületet, ha nem rendelkezik teljes körű képzettséggel, vagy nincs tisztában az ezzel járó veszélyekkel.

Milyen alkalmazási területei vannak az RNase A-nak?

A RNázok fontos szerepet játszanak az RNS lebontásában és forgalmában minden szervezetben. A ribonukleáz enzim az egyszálú RNS-szel komplexet alkotva képes az RNS-hélixet feltekerni.

Az RNáz A egy endoribonukleáz, amelynek funkciói az RNS-anyagcserében és a génexpresszió szabályozásában vannak.

Az RNáz A fontos szerepet játszik olyan betegségekben, mint az autoimmun betegségek, veseelégtelenségek és hasnyálmirigy-rendellenességek. Nemrégiben tumorellenes aktivitásról is beszámoltak egy citotoxikus és citosztatikus tulajdonságokkal rendelkező RNáz A esetében. Az RNáz A szupercsalád tagjai széles körben expresszálódnak és jelen vannak az emlősök szérumában és szöveteiben.

Az enzim felhasználható fehérjemintákból származó RNS hidrolizálására. Kompatibilis RNáz-védelmi vizsgálatokban, a nem specifikusan kötött RNS eltávolítására, RNS-szekvenciák analízisében, fehérjemintákban található RNS hidrolizálására és DNS-tisztításban.

Milyen a termék külleme/formája?

Fehér, kromatográfiailag tisztított, sómentes, fagyasztva szárított por formájában kerül forgalomba. A termék megjelenése/formája a gyártótól függően változhat.

Kiegészítő olvasmányok

• A DNS-szennyezés forrásai a laboratóriumban
• Guanidin-tiocianát az RNS-lízis pufferekben
• 8 előnye az AGS választásának. mint a Proteináz K szállítója