Ogólnym celem tego testu zahamowania hemaglutynacji jest pomiar miana przeciwciał przeciwko określonym wirusom. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny wakcynologii dotyczące odporności i ochrony poszczepiennej w różnych populacjach oraz w różnych grupach wiekowych i pacjentów. Głównymi zaletami tej techniki są jej dokładność i możliwość szybkiego oznaczania miana przeciwciał neutralizujących.
Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w miano przeciwciał u ludzi, może być również stosowana w innych systemach, takich jak miano przeciwciał w surowicy myszy, a także w supernatantach hodowli. Rozpocznij od oznaczenia 96-dołkowych płytek mikrotitracyjnych odpowiednimi informacjami eksperymentalnymi. Następnie odwrócić płytkę w orientacji pionowej i użyć pipety wielokanałowej, aby dodać 25 mikrolitrów PBS do każdej studzienki, z wyjątkiem pierwszej studzienki w dolnym rzędzie miareczkowania wstecznego.
Dodać 50 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu antygenu do pierwszej studzienki w rzędzie miareczkowania wstecznego, a następnie dodać 25 mikrolitrów próbek surowicy poddanych działaniu RDE do pierwszych studzienek w górnych dziesięciu rzędach. Dodać 25 mikrolitrów odpowiedniej surowicy do pierwszego basenika w jedenastym rzędzie jako kontrolę dodatnią. Następnie przenieść 25 mikrolitrów z pierwszego dołka każdego rzędu do kolejnych dołków, aby wykonać seryjne, dwukrotne rozcieńczenia.
Pipetować w górę i w dół 10 do 15 razy dla każdego kroku rozcieńczenia, odrzucając ostatnie 25 mikrolitrów z ostatnich dołków. Następnie dodać 25 mikrolitrów roztworu antygenu do każdej studzienki w rzędach od 1 do 11 i 25 mikrolitrów samego PBS do każdej studzienki w rzędzie tylnego miareczkowania. Ostrożnie postukać płytkę 10 razy we wszystkie cztery strony w celu wymieszania.
Następnie przykryć płytkę na 30 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji, dodać 50 mikrolitrów roztworu krwinek czerwonych do każdej studzienki i wymieszać płytkę z większą ilością stuknięć. Następnie ponownie przykryć płytkę i inkubować krwinki czerwone zgodnie z używanymi gatunkami, jak podano w tabeli.
Po dodaniu krwinek czerwonych do płytki, przestrzegać odpowiedniego czasu inkubacji dla rodzaju krwi używanej w badaniu. Zbyt krótka lub zbyt długa inkubacja doprowadzi do nieprawidłowej interpretacji wyników. Pod koniec inkubacji ocenić hemaglutynację, przechylając płytkę o 90 stopni przez 25 sekund i zaznaczyć wyniki dla każdej studzienki, gdy płytka jest jeszcze przechylona, na wydrukowanym schemacie 96 studzienkowej płytki.
W tym eksperymencie oceniano odpowiedź przeciwciał wywołaną szczepionką u 26 zdrowych ochotników, którzy otrzymali inaktywowaną, trójwartościową szczepionkę przeciw grypie zawierającą grypę A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 i B/Massachusetts/O2/2012 przed sezonem grypy 24 2015. Zaobserwowano krzyżową reakcję immunologiczną dla szczepów wirusa A/H3N2/Szwajcaria/2013 i A/H3N2/Texas/2012, z istotnie niższymi średnimi geometrycznymi mianami zahamowania hemaglutynacji i indukowaną seroprotekcją przeciwko grypie A/H3N2/Szwajcaria/2013 w porównaniu z grypą A/H3N2/Texas/2012. Po szczepieniu wzrosły miana przeciwciał przeciwko obu szczepom, mimo że szczep A/H3N2/Szwajcaria/2013 nie był obecny w szczepionce.
Hemaglutynina wirusowa wykazuje zależny od gatunku potencjał do hemaglutynacji erytrocytów. Co ciekawe, krew świnki morskiej nie hemaglutynuje prawidłowo z grypą B, a krew indyka ma potencjał do hemaglutynacji z wysokimi mianami i niską reaktywnością krzyżową. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu trzech godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo.
Podejmując tę procedurę należy pamiętać o surowicy z RDE w celu inaktywacji wszelkich niespecyficznych inhibitorów i niespecyficznych wiązań podczas hemaglutynacji wirusa. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak ELISA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące roli immunoglobulin specyficznych dla poszczególnych patogenów. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie immunologii wirusowej do dalszego zrozumienia odporności związanej ze szczepionką u zdrowych i poddanych immunosupresji pacjentów w różnych grupach wiekowych.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przeprowadzić test zahamowania hemaglutynacji w celu określenia ilościowego miana przeciwciał specyficznych dla szczepu grypy na dużą skalę. Nie zapominaj, że praca z antygenami wirusowymi, krwią zwierzęcą i próbkami surowicy ludzkiej może być bardzo niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak praca w laboratorium BSL2.