Wprowadzenie
Istnieje około 10,000 nazwanych gatunków mikrobów. Szacuje się, że istnieje od 10 000 do 100 000 więcej niezidentyfikowanych gatunków na każdy zidentyfikowany. Istnieje nie tylko wiele rodzajów bakterii, ale również wiele pojedynczych bakterii. Jedna łyżka ziemi może zawierać 100 milionów pojedynczych bakterii. Skrobanie dziąseł może dostarczyć 1 milion bakterii na cm2 (cm2 jest mniej więcej wielkości małego paznokcia). Bakterie w i na naszych ciałach stanowią około 10% naszej suchej masy ciała.
Większość znanych obecnie gatunków bakterii została zidentyfikowana przy użyciu tradycyjnych technik mikrobiologicznych, takich jak barwienie metodą Grama, morfologia i reakcje metaboliczne. Bakterie rzadko żyją samotnie, ale w społecznościach z innymi bakteriami. Jest to prawdą zarówno w środowisku naturalnym jak i w naszych ciałach. Zajęcia te koncentrują się na roli bakterii w chorobach. Wyizolowanie pojedynczego gatunku bakterii jest pierwszym krokiem w identyfikacji bakterii prawdopodobnie odpowiedzialnych za proces chorobowy.
Pierwszym wymogiem dla fizycznego wyizolowania bakterii jest to, że może być ona hodowana w laboratorium. Wymaga to wiedzy na temat optymalnej temperatury dla wzrostu, optymalnego zapotrzebowania na tlen i optymalnych potrzeb żywieniowych. W tym kursie pracujemy z bardzo ograniczoną liczbą bakterii. Bakterie, z którymi pracujemy są również bardzo łatwe do wyhodowania w laboratorium. Większość bakterii nie jest tak ugodowa!
Istnieją dwa główne sposoby izolowania organizmów.
- Wyodrębnianie w celu izolacji na płytce agarowej
- Metoda zalewania
Wyodrębnianie w celu izolacji na płytce agarowej polega na sukcesywnym rozcieńczaniu organizmów, aż do uzyskania komórek o wystarczająco niskiej gęstości, aby pojedyncze komórki były fizycznie izolowane przestrzennie, dając początek rozpoznawalnym indywidualnym koloniom. W metodzie „pour plate” próbkę rozcieńcza się wystarczająco przed dodaniem jej do stopionego, schłodzonego agaru, a następnie wylewa się tę mieszaninę do naczynia. Wyizolowane komórki dają początek pojedynczym koloniom rosnącym w samym agarze. Technika ta może być nieco kłopotliwa. Jeśli roztopiony agar jest zbyt gorący, zabijasz wszystkie bakterie. Jeśli roztopiony agar jest zbyt chłodny, powstaje wielka bryła w szalce Petriego. Metoda posiewu smugowego pozwala uzyskać pojedyncze kolonie na powierzchni agaru. Ta technika jest znacznie szybsza i łatwiejsza do opanowania.
Przegląd
Dostaniesz próbkę bulionu zawierającą trzy organizmy, Staphylococcus xylosus, Serratia marsescens i Escherichia. coli.
Wszystkie trzy organizmy łatwo rosną tlenowo na tryptycznym agarze sojowym (TSA). Jednakże S. marsescens tworzy czerwony pigment tylko w temperaturze 35°C lub niższej, a optymalnie w temperaturze pokojowej (25°C). Rośnie bardzo szybko we wszystkich temperaturach tworząc średniej wielkości kolonie.
E. coli ma brązowy wygląd we wszystkich temperaturach i jest również szybko rosnącym organizmem tworzącym duże kolonie.
S. xylosus ma żółto-pomarańczowy wygląd we wszystkich temperaturach, rośnie szybko i tworzy średnie lub duże kolonie.
Twoja zdolność do wyizolowania i zobaczenia trzech organizmów na płytce zależy od odpowiednich warunków inkubacji. Wasze płytki będą inkubowane w temperaturze pokojowej przez 48 godzin. Powinieneś być w stanie zidentyfikować trzy organizmy na podstawie wielkości kolonii i pigmentu.
Materiały
- 1 mieszana hodowla w probówce z tryptycznym bulionem sojowym (TSB) zawierająca Staphylococcus xylosus, Serratia marsescens, i Escherichia. Coli (wszystkie BSL2)
- 3 płytki TSA
Streaking for Isolation Procedure
Istnieje kilka metod streaking for isolation. Zdecydowana większość naszych studentów odnosiła największe sukcesy z metodą kwadrantową, która jest opisana poniżej.
- Nazwać płytkę swoim nazwiskiem, datą, sekcją i organizmem.
- Użyć procedur BSL2 w celu uzyskania pętli pełnej organizmów z probówki z bulionem sojowym tryptycznym (TSB). Odnieść się do protokołu techniki aseptycznej.
- Upewnić się, że probówka z bulionem została odpowiednio wymieszana, tak aby organizmy były jednolicie zawieszone w bulionie.
- Odstawić probówkę z bulionem TSB.
- Następną część można wykonać z płytką na stole laboratoryjnym lub trzymając ją w ręku. Sam zdecyduj, co będzie najlepsze. Lekko przeciągnij pętlę tam i z powrotem po powierzchni agaru. (Patrz Rysunek 1.)
- Im bardziej przeciągasz, tym więcej bakterii osadza się na płytce.
- Ogólny pomysł polega na zmniejszeniu stężenia bakterii z każdym machnięciem.
- Cztery do pięciu zygzaków wydaje się działać dobrze.
- Przeprowadź eksperymenty z różnymi płytkami. Pamiętaj, aby śledzić, co zrobiłeś na każdej płycie.
- Jeśli używasz spalacza, wysterylizuj swoją pętlę. Jeśli używasz plastikowych pętli, wyrzuć zużytą pętlę do pojemnika z kawicydem i uzyskaj nową sterylną plastikową pętlę.
- Nie wracaj do oryginalnej probówki z bulionem.
- Dotknij pętlą do powierzchni agaru w kierunku dalekiego końca pierwszej smugi. Powtórz, przeciągając tam i z powrotem.
- o Nie przeciągaj do środka płytki.
- o Powinieneś być w stanie zobaczyć słabe wgłębienia linii smug na powierzchni agaru.
- Używając sterylnej pętli, powtórz procedurę na drugiej smudze.
- Używając sterylnej pętli, powtórz procedurę na trzeciej smudze. Zygzakuj ostatnią część do środka płytki.
- Powinieneś skończyć z wyizolowanymi koloniami gdzieś w ostatniej smudze.
- Jeśli używasz spalarki, wysterylizuj pętlę. Jeśli używasz plastikowych pętli, wyrzuć zużytą pętlę do pojemnika na kawitację.
- Załóż pokrywkę na płytkę.
- Umieść gotowe płytki agarem do góry na stojaku do inkubacji na przednim biurku w sekcji inkubacyjnej.
Rysunek 1: Metoda kwadrantowa wykonywania posiewów w celu izolacji.
Przypisy
- Bardzo ważne jest, aby sterylizować pętlę pomiędzy każdym posiewem, albo przez użycie spalarki, albo przez uzyskanie nowej sterylnej plastikowej pętli. Jest to najczęstszy błąd popełniany przez studentów.
- Nie pozostawiaj otwartej płytki zbyt długo lub dodatkowe bakterie z otoczenia wpadną na płytkę.
- Nie bądź rozczarowany jeśli nie uzyskasz izolowanych kolonii przy pierwszej próbie. To jest trudna procedura.
.