Instrument i odczynniki
Przyrządem do wykrywania MTX był Siemens VIVA-E, który pozwala na dostosowanie parametrów dzięki dostępności kanału otwartego. Odczynniki i kalibratory MTX zostały zakupione od firmy Siemens (6L119UL).
Trzy poziomy materiału kontroli jakości (QC) zostały zakupione od firmy Bio-Rad (Irvine, CA), dodatkowy niestandardowy materiał QC na poziomie 0,05 μmol/L od firmy Aladdin (Shanghai, China).
Porównanie metod MTX przeprowadzono analizując te same próbki przy użyciu chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) (chromatografia cieczowa LC-20 AD i spektrometry masowe AB SCIEX QTRAP®4500).
Próbki
Próbki badane uzyskano z oddziału hematologicznego szpitala dziecięcego w Dalian. Kilka przetestowanych próbek i MTX-free icteric próbki osocza były zebrane dla studiowania na triglicerydach i bilirubinie interferencji. Nie było żadnej interwencji w leczeniu pacjentów i żadna z indywidualnych informacji pacjenta nie została wspomniana.
Przygotowanie odczynników
Zestaw odczynników firmy Siemens zawiera odczynnik A z przeciwciałem/substratem, odczynnik B z enzymem, koncentrat buforowy Emit Drug Assay oraz kalibratory metotreksatu Emit. Odczynnik A i B zostały odtworzone w 3,0 ml dejonizowanej wody, wymieszane przez delikatne wirowanie i wyrównane w temperaturze pokojowej przez 1 h. Koncentrat buforowy MTX został wymieszany z dejonizowaną wodą (1:15 v/v). Roztwór roboczy odczynnika A i B przygotowano przez rozcieńczenie roztworów podstawowych 1:9 v/v roztworem buforowym.
Niektóre kalibratory (0, 0.20, 0.50, 1.00 μmol/L) odtworzono do wskazanego stężenia z 1.0 mL wody dejonizowanej zgodnie z instrukcją producenta, inne kalibratory 1,50 i 2,00 μmol/L były rekonstytuowane do 1,00 μmol/L odpowiednio z 1,50 i 2,00 mL wody dejonizowanej. Następnie kalibrator 0,20 μmol/L rozcieńczono do 0,05 μmol/L, a kalibrator 1,00 μmol/L rozcieńczono do 0,10 i 0,25 μmol/L. Nowy zestaw kalibratorów (0, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50 i 1,00 μmol/L) spełnia wymagania zmodyfikowanej krzywej kalibracyjnej.
Programowanie aparatu Viva-E
Zaprogramowano otwarty kanał w aparacie Viva-E w celu zmiany objętości odczynników A & B z 180 μL do 110 μL (110 μL to dolna granica Viva-E dla odczynników MTX). Sześciopunktowa krzywa kalibracyjna została zaprogramowana za pomocą zmodyfikowanej regresji splajnu sześciennego. Sześć kalibratorów dostarczonych przez zestaw wynosiło 0, 0,20, 0,50, 1,00, 1,50 i 2,00 μmol/L. Gdy zmniejszono objętości odczynników A i B, nie były one wystarczające do reakcji z próbkami o stężeniu większym niż 1 μmol/L. W rezultacie nowy zestaw kalibratorów zmodyfikowanego testu EMIT zmieniono na 0, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 μmol/L w zakresie od 0,05 do 1,00 μmol/L.
Zgodnie z instrukcją zestawu komercyjnego próbki o stężeniu większym niż 1,00 μmol/L należy rozcieńczyć do zakresu krzywej kalibracyjnej (0.05-1,00 μmol/L) stosując współczynnik rozcieńczenia 10, 100 lub 1000.
Limit ślepej próby, granica wykrywalności, granica oznaczalności
Limit ślepej próby (LOB), granica wykrywalności (LOD), granica oznaczalności (LOQ) zostały określone zgodnie z CLSI EP17-A . LOB oznaczano przy użyciu sześciu próbek (S1-S6, 10 powtórzeń w ciągu 10 dni): S1 i S2 były zerowymi kalibratorami z dwóch różnych serii kalibratora, S3 i S4 były rozcieńczalnikiem, S5 i S6 były ślepym osoczem. LOD została oznaczona z 5 pulami próbek o niskim poziomie, w zakresie od LOB do czterokrotności LOB (12 powtórzeń w ciągu 12 dni). LOB i LOD zostały określone przez dwie serie odczynników. Zgodnie z wymaganiami klinicznymi, cel dla błędu całkowitego został ustalony na poziomie 20%. Wyniki badania LOD wykorzystano do oszacowania błędu systematycznego i niedokładności dla każdego poziomu analitu. Następnie dane te zostały połączone w celu oszacowania całkowitego błędu na każdym poziomie i określenia granicy oznaczalności (LOQ).
Nieprecyzyjność śróddzienna i międzydzienna
Nieprecyzyjność śróddzienna (n = 10) zmodyfikowanego testu została oceniona przez jeden poziom materiałów kontrolnych (0,05 μmol/L) i trzy poziomy próbek pacjentów (0,12, 0,43, 0,82 μmol/L). Na każdym poziomie przeprowadzono 10 powtórzeń. Niedokładność międzydobową (n = 25) badano na tych 4 poziomach w 5 kolejnych dniach, po 5 powtórzeń dla każdego poziomu. Wszystkie próbki pochodziły od różnych pacjentów. Zmierzone wyniki wykreślono względem wartości oczekiwanych.
Liniowość
Liniowość sprawdzono rozcieńczając kontrolę jakości o stężeniu 2,00 μmol/L (hc) buforem (c0) w następujących proporcjach: 1hc + 1c0 (1,00 μmol/L), 2hc + 3c0 (0,80 μmol/L), 1hc + 2co (0,67 μmol/L), 1hc + 3co (0.50 μmol/L), 1hc + 5co (0,33 μmol/L), 1hc + 9co (0,20 μmol/L), 1hc + 19co (0,10 μmol/L), 1hc + 39co (0,05 μmol/L). Każde rozcieńczenie analizowano trzykrotnie, równanie liniowości zmodyfikowanego oznaczenia obliczono na podstawie średnich wyników pomiarów i wartości oczekiwanych.
Procedura oznaczania LC-MS/MS
Procedura oznaczania LC-MS/MS przeprowadzona w tym badaniu jest następująca. Difenhydramina została użyta jako standard wewnętrzny. Acetonitryl został użyty jako środek strącający surowicę w celu wyeliminowania albuminy. Do rozdzielania LC użyto kolumny Hypersil ODS-BP C18 (5 μm, 2,1 × 150 mm). Fazę ruchomą stanowił 0,1% kwas mrówkowy i acetonitryl. Elucję gradientową prowadzono przy szybkości przepływu 0,5 mL/min w temperaturze 30 °C. Do wykrywania MTX i difenhydraminy zastosowano tryb monitorowania wielu reakcji (MRM) w źródle jonizacji elektrospray (ESI) i trybie skanowania jonów dodatnich. MTX został wykryty przy m/z 455.0 → 308.1, difenhydramina została wykryta przy m/z 256.0 → 167.0 .
Porównanie metod
Siedemdziesiąt dziewięć próbek zostało pobranych od pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną w Oddziale Hematologicznym szpitala dziecięcego w Dalian. Każda próbka została przebadana przy użyciu zmodyfikowanego testu EMIT i odpowiednio testu LC-MS/MS. Wyniki zostały porównane przy użyciu prostej analizy regresji liniowej (MedCalc Statistical Software version 15.6.1). Kolejne 45 próbek badano przy użyciu zmodyfikowanego testu EMIT i komercyjnego testu EMIT w celu porównania metod.
Badania interferencji
Interferencję triglicerydów oceniano poprzez przygotowanie próbek z Intralipidem (20% emulsja tłuszczowa IV). Stężenie triglicerydów w próbkach wynosiło 1000 ng/dL. Następnie wykonano test Paired-T.
Interferencja bilirubiny została zasymulowana przy użyciu niektórych próbek osocza bez MTX ikterycznego o stężeniu bilirubiny nie mniejszym niż 30 mg/dL.
Interferencja od strukturalnie powiązanego metabolitu 7-hydroksymetotreksatu została oceniona przez dodanie różnych poziomów 7-hydroksymetotreksatu do próbek osocza, stężenie MTX w tych próbkach wynosiło 0,05 μmoL/L. I wyniki badań bieżących próbek zostały porównane z wynikami oryginalnych próbek .
.