Przeciwciała z pojedynczą domeną, lub nanobodies, zostały ostatnio rzucone na światło dzienne jako potencjalne leczenie COVID-19. W rzeczywistości, leczenie COVID-19 oparte o nanobody opracowane przez Beroni Group, australijską firmę biotechnologiczną, jest obecnie w fazie badań przedklinicznych. Mimo że nanobody dopiero zaczynają realizować swój potencjał terapeutyczny, są badane od dziesięcioleci.
W 1989 roku dwóch absolwentów Vrije Universiteit Brussel przypadkowo odkryło unikalną właściwość wielbłądów (m.in. wielbłądów, lam i alpak). Badając zamrożoną surowicę krwi wielbłądów, studenci odkryli, że wielbłądowate nie tylko wytwarzają konwencjonalne przeciwciała, ale także unikalny wtórny zestaw jednołańcuchowych przeciwciał (scAbs) składający się z dwóch identycznych polipeptydów o ciężkich łańcuchach, z których każdy zawiera dwie przylegające domeny stałe, region zawiasowy i domenę zmienną. (Domeny stałe każdego łańcucha ciężkiego biegną równolegle; poza regionem zawiasowym, domeny zmienne rozchodzą się jak ramiona litery „Y”). Każda ze zmiennych domen scAb służy jako moduł wiążący antygen.
To ekscytujące odkrycie to był dopiero początek. Kolejne prace ujawniły, że do rozpoznania antygenu potrzebny jest tylko niewielki fragment scAb, pojedyncza zmienna domena. Fragment ten waży zaledwie 12-15 kDa, stąd nazwa „nanobiałko”.”
W przeciwieństwie do tego, ludzkie przeciwciała składają się z dwóch identycznych polipeptydów łańcucha ciężkiego i dwóch identycznych polipeptydów łańcucha lekkiego. Białka te są duże, o masie cząsteczkowej około 150 kDa. W przeciwieństwie do przeciwciał wielbłądów, miejsce wiązania antygenu ludzkich przeciwciał obejmuje zarówno łańcuch ciężki, jak i lekki (lub raczej zmienne domeny tych łańcuchów), co oznacza, że wszystkie łańcuchy są potrzebne do wykrycia antygenu.
Zalety nanobiałek
Ponieważ ludzkie przeciwciała są duże, często mają trudności z dostępem do małych miejsc wiązania na wirusach, niektórych komórkach i celach głęboko w tkance nowotworowej. Jednak małe nanobody mogą poruszać się w ciasnych przestrzeniach i mogą być atrakcyjną alternatywą dla ludzkich przeciwciał dla twórców terapii. Dodatkowo, domena wiążąca nanoprzeciwciał jest długa, tworząc strukturę „podobną do palca”, która zwiększa zdolność nanoprzeciwciał do osiągania swoich celów.
Jedną z ogromnych zalet nanoprzeciwciał, w porównaniu z konwencjonalnymi ludzkimi przeciwciałami, jest ich łatwa wytwarzalność. Stosunkowo prosty proces rozpoczyna się od immunizacji wielbłąda pożądanym antygenem. System immunologiczny wielbłąda wytwarza scAb, które rozpoznaje antygen. Następnie pobiera się próbkę krwi od wielbłąda (który poza tym pozostaje nieuszkodzony), a z próbki wyodrębnia się mRNA dla scAb.
Geny dla zmiennej domeny wiążącej antygen, czyli nanobakterii, są następnie amplifikowane z mRNA. Duże ilości końcowej nanobiocyny mogą być następnie produkowane wewnątrz mikroorganizmów, zazwyczaj Escherichia coli, przy niskich kosztach.
Nowsze metody całkowicie eliminują zwierzęta z równania, testując antygeny przeciwko wcześniej wyprodukowanej bibliotece nanobiałek. Twist Bioscience, poprzez swój oddział Twist BioPharma, oferuje kilka rodzajów bibliotek nanobiałek w ramach lama scAb lub częściowo humanizowanych scAb. Miliardy sekwencji nanobiałek mogą być testowane jednocześnie, co sprawia, że odkrywanie i rozwój przeciwciał jest niezwykle szybkie i stosunkowo niedrogie.
Zastosowanie nanobiałek
Początkowo nanobiałka były używane tylko lub głównie do celów badawczych. Jednak eksploracja zastosowania nanobodies jako terapeutycznych dramatycznie wzrosła w ciągu ostatniej dekady. W lutym 2019 r. dokonano znaczącego postępu, gdy pierwsza terapia nanobiałkami została zatwierdzona przez FDA.
Lek, o nazwie Cablivi, został opracowany przez firmę Ablynx do leczenia nabytej zakrzepowej plamicy małopłytkowej. Cablivi działa jak czynnik anty-Von Williebranda i zapobiega agregacji płytek krwi wokół narządów.
Nanobodies dla różnych warunków są w fazie badań klinicznych. Na przykład, nanobodies są oceniane jako leki na łuszczycę, reumatoidalne zapalenie stawów i infekcje wirusowe.
Oprócz tego, że stanowią terapie samodzielne, nanobodies mogą przyczynić się do terapii skojarzonych. Interesujące są próby kliniczne badające połączenie nanobiałek i terapii chimerycznych receptorów antygenowych (CAR) komórek T w leczeniu raka.
Komórki CAR T są genetycznie przystosowane do rozpoznawania i celowania w antygeny na powierzchni guza. Jak dotąd, terapie CAR T-komórkowe były bardzo obiecującymi metodami leczenia nowotworów krwi, które nie reagują na bardziej konwencjonalne metody leczenia. Jednak terapie CAR T-komórkowe nie odniosły jeszcze sukcesu w walce z guzami litymi.
Aby zająć się guzami litymi, CAR T-komórki mogą potrzebować alternatywnych celów. Zwykłe cele obejmują antygeny specyficzne dla raka, które są trudne do znalezienia, oraz antygeny związane z rakiem, które są łatwiejsze do znalezienia, ale trudniejsze do bezpiecznego zaangażowania, ponieważ pojawiają się również na zdrowych komórkach.
Te cele stwarzają jeszcze jedną trudność. Zwykle są one namierzane przez komórki CAR T, które zawierają domenę rozpoznającą antygen pochodzącą z ludzkiego przeciwciała monoklonalnego. Jednakże ludzkie przeciwciała mogą powodować immunogenność prowadzącą do efektów ubocznych i zmniejszenia skuteczności komórek CAR T.
Jakie alternatywne cele mogą być odpowiednie? Możliwości obfitują w macierz pozakomórkową, sieć białek, która osłania guzy lite i jest siedliskiem cząsteczek immunosupresyjnych. Pomysł uderzenia w cele w macierzy pozakomórkowej spodobał się naukowcom z Boston Children’s Hospital. Ostatecznie naukowcy ci postanowili skonstruować komórki CAR T z domenami rozpoznającymi antygen pochodzącymi z nanobiałek.
Używając mysich modeli raka, naukowcy wykazali, że komórki CAR T oparte na nanobiałkach są tylko słabo immunogenne i zdolne do rozpoznawania specyficznych antygenów w mikrośrodowisku guza. W celu skonstruowania tych komórek CAR T naukowcy wykorzystali metodę Gibson Assembly, technikę pozwalającą na łączenie i klonowanie wielu fragmentów DNA.
Konstrukcje komórek CAR T z nanobiałkami są zdolne do uszkadzania odżywiających guza naczyń krwionośnych i chroniących guza elementów macierzy zewnątrzkomórkowej. Uszkodzenie mikrośrodowiska guza znacznie spowalnia jego wzrost i umożliwia innym metodom leczenia, takim jak chemioterapia, dostęp do wnętrza guza.
Kwestie związane z rozwojem nanobiałek
Minęło 30 lat od odkrycia nanobiałek w 1989 roku, zanim terapia z wykorzystaniem nanobiałek trafiła na rynek. Pierwsze 10 lat koncentrowało się na badaniach nad strukturą, składem i właściwościami nanobiałek. Tuż po upływie 10 lat, w 2001 roku, Vrije Universiteit Brussel podjął próbę komercjalizacji nanobiałek, uzyskując wiele patentów na swoje nazwisko. Patenty te zostały następnie przekazane do Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie (VIB), a następnie do założonej przez VIB firmy Ablynx w 2002 roku.
Prawdopodobnie ograniczenia własności intelektualnej dotyczące składu materii nanobiałek przyczyniły się do długiego opóźnienia między odkryciem nanobiałek a pierwszym zatwierdzeniem leku opartego na nanobiałkach. Jednak główne zastrzeżenia patentowe dotyczące tej biomolekuły wygasły w 2014 roku w Europie i 2017 roku w Ameryce, co pozwoliło firmie Ablynx znacznie rozszerzyć współpracę z niektórymi z największych firm farmaceutycznych na świecie, w tym Merck & Co., Boehringer Ingelheim i Sanofi.
Wynikiem tych współpracy jest nagły wzrost liczby rejestrowanych badań klinicznych z udziałem nanobiałek i długo oczekiwane zatwierdzenie leku Cablivi. Dodatkowo, zmniejszające się bariery własności intelektualnej związane ze składem materii nanobodów pozwoliły jeszcze większej liczbie firm wykazać zainteresowanie dalszą komercjalizacją tych supercząsteczek.
Jak wszystkie terapie, nanobody mają wady. Ich mały rozmiar powoduje szybki klirens przez nerki, zmniejszając ich okres półtrwania. Dlatego, aby zapewnić wystarczająco dużą ilość nanobiałek we krwi dla osiągnięcia pożądanego efektu, wymagane jest częste dawkowanie, co może wywołać toksyczność nerek. Istnieje również niewielkie ryzyko, że pacjenci mogą mieć odpowiedź immunologiczną na terapeutyczne nanobodies, ponieważ są one materiałem biologicznym.
Na szczęście problemy te można przezwyciężyć. Badania wykazały, że połączenie nanobiałek z albuminą surowicy, obfitym białkiem transportowym występującym we krwi, znacznie wydłuża okres półtrwania nanobiałek, pozwalając im pozostawać we krwi dłużej i w większych ilościach. Immunogenność nanobiałek można zmniejszyć poprzez humanizację, czyli proces, który modyfikuje niektóre sekwencje białek nanobiałek, aby zwiększyć ich podobieństwo do ludzkich przeciwciał, zmniejszając ryzyko negatywnej reakcji immunologicznej.
Pomimo opóźnień w komercjalizacji nanobiałek jako terapeutyków, teraz, gdy wiele firm jest w stanie zainwestować w te wspaniałe i unikalne cząsteczki, przewiduje się, że wkrótce nastąpi eksplozja nanobiałek stosowanych jako terapeutyki na wiele chorób, od infekcji wirusowych po nowotwory. Nanobody wielbłąda nie tylko dowiodły swojej wartości, ale mogą również zmienić krajobraz terapii przeciwciałami i zapoczątkować nową generację terapii.