Biofizyk Adam Cohen przechadzał się po San Francisco w Kalifornii w 2010 roku, kiedy zaskoczył go telefon. „Mamy sygnał” – powiedział rozmówca. Prawie 5000 kilometrów dalej, w Cambridge w stanie Massachusetts, jego współpracownicy natrafili na złoto. Po miesiącach nieudanych eksperymentów badacze znaleźli białko fluorescencyjne, które pozwoliło im obserwować sygnały przechodzące między neuronami.
Ale działo się coś dziwnego. Kiedy Cohen wrócił do swojego laboratorium na Uniwersytecie Harvarda, dowiedział się, że wszystkie nagrania z eksperymentu wykazały dziwną progresję. Na początku neurony ozdobione białkiem ładnie migały, gdy przepływały przez nie impulsy elektryczne. Ale potem komórki zamieniły się w jasne plamy. „W połowie każdego nagrania sygnał zaczynał szaleć” – mówi Cohen.
Więc postanowił dołączyć do swojego zespołu podczas eksperymentu. „Kiedy zaczynali nagrywanie, siedzieli tam i wstrzymywali oddech” – mówi Cohen. Ale jak tylko zdali sobie sprawę, że to działa, świętowali, „tańcząc i biegając po pokoju”.
W swoim uniesieniu pozwalali, aby światło z lampki biurkowej świeciło prosto na mikroskop. „Nagrywaliśmy nasze podniecenie” – mówi Daniel Hochbaum, wówczas student w grupie Cohena. Stonowali swoje świętowanie, a rok później zespół opublikował swoje badania1 – jedne z pierwszych, które pokazują, że białko fluorescencyjne wprowadzone do konkretnych neuronów ssaków może być użyte do śledzenia indywidualnych impulsów elektrycznych w czasie rzeczywistym.
Naukowcy od dziesięcioleci próbują obserwować szybkie sygnały elektryczne, które są głównym składnikiem języka mózgu. Chociaż elektrody, koń roboczy do pomiaru napięcia, mogą niezawodnie rejestrować aktywność poszczególnych neuronów, zmagają się z uchwyceniem sygnałów wielu, szczególnie przez dłuższy czas. Jednak w ciągu ostatnich dwóch dekad naukowcy znaleźli sposób na umieszczenie fluorescencyjnych białek wskazujących napięcie bezpośrednio w błonach komórkowych neuronów. Dzięki odpowiedniemu mikroskopowi mogą oni zobaczyć, jak komórki świecą, rozmawiając ze sobą – czy to szeptem, czy krzykiem. Obrazowanie napięciowe może również rejestrować rozmowy elektryczne między wieloma neuronami jednocześnie, a następnie uśredniać te sygnały w dużych fragmentach tkanki mózgowej. Dzięki temu naukowcy mogą badać aktywność elektryczną mózgu w różnych skalach przestrzennych, wsłuchując się nie tylko w głosy poszczególnych komórek, ale także w „ryk tłumu” – mówi Cohen.
W ciągu ostatnich 5 lat naukowcy opublikowali około 1000 prac na ten temat, a główne programy finansowania, takie jak inicjatywa BRAIN amerykańskich Narodowych Instytutów Zdrowia, przyspieszyły rozwój nowych typów genetycznie zmodyfikowanych wskaźników napięcia. W nadziei na znalezienie lepszych wariantów, niektóre grupy wymyśliły strategie przesiewania milionów białek pod kątem pożądanych cech, takich jak jasność. Jedno z takich podejść pozwoliło zidentyfikować wskaźnik, który jest dwa razy jaśniejszy niż podobne czujniki opracowane zaledwie cztery lata wcześniej2.
As these proteins improve, and advances in microscopy make it easier to see them, scientists hope to illuminate neuroscience’s biggest puzzle: how the brain’s cells work together to transform a system of electrical pulses into thoughts, actions and emotions. Naukowcy wciąż mają trudności z uchwyceniem pełnego zakresu aktywności i opracowaniem sposobów na zobaczenie nerwów szybko i głęboko w tkance mózgowej. Jeśli jednak uda się rozwiązać te techniczne wyzwania, „będzie to rewolucyjne”, mówi Rafael Yuste, który bada funkcjonowanie obwodów neuronowych na Uniwersytecie Columbia w Nowym Jorku.
Szybki proces
Przeciętny ludzki mózg zawiera około 120 miliardów neuronów, które nieustannie odbierają i wysyłają informacje za pośrednictwem rozgałęzionych wyrostków zwanych dendrytami. Sygnały chemiczne lub elektryczne, które docierają do dendrytów, powodują niewielkie zmiany napięcia w błonie komórkowej, które są kierowane do ciała komórki. Kiedy suma zmian napięcia osiągnie punkt bez powrotu, zwany progiem, neuron wystrzeliwuje duży impuls elektryczny – potencjał czynnościowy. Ten impuls pędzi z prędkością do 150 metrów na sekundę wzdłuż gałęzi neuronu, zwanej aksonem, do innego zestawu rozgałęzionych wyrostków. Tutaj sygnały chemiczne lub elektryczne przekazują informacje do następnego zestawu dendrytów.
Sygnały neuronalne zbiegają się, rozbiegają i synchronizują, tworząc symfonię myśli, emocji, działań i reakcji, od rumieńca na twarzy po czkawkę dziecka. Jednak narzędzia słuchowe naukowców są bardzo ograniczone. Opracowane po raz pierwszy w latach 40. ubiegłego wieku miniaturowe elektrody, cienkie jak włos, mogą być wprowadzane do mózgu, naprzeciwko lub wewnątrz neuronów, gdzie precyzyjnie i szybko mierzą napięcie membran. Jednak takie podejście może być stosowane do monitorowania tylko jednego lub kilku neuronów jednocześnie – i to tylko przez ograniczony czas, ponieważ elektrody w końcu uszkadzają komórki. To jak próba uchwycenia sedna orkiestrowej aranżacji poprzez śledzenie jednego gracza przez kilka sekund.
Wiązki mikroelektrod mogą rejestrować aktywność elektryczną do 200 komórek na raz, ale ponieważ te elektrody są umieszczone w pobliżu neuronów, a nie wewnątrz nich, mogą wykryć tylko potencjały czynnościowe, najostrzejsze skoki w aktywności elektrycznej. Są głuche na delikatniejsze nuty – małe zmiany elektryczne, które nie popychają neuronu aż do potencjału czynnościowego. Te podprogowe zmiany napięcia są kluczowe dla funkcji mózgu, ponieważ stopniowo sumują się, aby określić, czy neuron będzie strzelał, czy nie.
W nadziei na pomiar spokojniejszej aktywności mózgu w większych populacjach komórek, naukowcy w latach 60. zaczęli bawić się pomysłem czujnika lub sondy, która fluoryzuje w odpowiedzi na sygnał elektryczny. Najbardziej popularne sondy, zwane wskaźnikami wapnia, świecą się, gdy wiążą się z wapniem, który przepływa do neuronu w wyniku skoku aktywności elektrycznej. Jednak technika ta, znana jako obrazowanie wapnia, dostarcza tylko przybliżonych informacji; nie rejestruje bezpośrednio napięcia membrany. I choć pokaże sygnał dużych zdarzeń, takich jak potencjały czynnościowe, to jednak pominie rzeczy kluczowe dla funkcjonowania mózgu, takie jak subtelne wahania napięcia błony lub sygnały elektryczne, które hamują potencjały czynnościowe. Wyobraźmy sobie, że słyszymy tylko oklaski po koncercie symfonicznym: to jasne, że orkiestra grała, ale co grała, to już każdy może się domyślić.
W latach 70. naukowcy zaczęli opracowywać czujniki barwnikowe, które bezpośrednio wykrywają zmiany w napięciu membranowym. Pierwsze wersje tych barwników musiały być malowane na mózgu w sposób niedyskretny, więc znakowały wszystkie typy komórek, w tym komórki nieneuronalne, co utrudniało rozróżnienie aktywności konkretnych neuronów.
W latach 90. badacze zaczęli testować wskaźniki, które można było genetycznie zmodyfikować tak, aby pojawiały się tylko w interesujących nas neuronach. Pierwszy3 genetycznie kodowany wskaźnik napięcia (GEVI) został opracowany w 1997 roku; od tego czasu naukowcy stworzyli ponad dwa tuziny czujników4. Niektóre z nich powstają poprzez połączenie białka wrażliwego na napięcie z cząsteczkami fluorescencyjnymi (zob. „Smaki fluorescencji”). Gdy białka te wykrywają zmianę napięcia, zmieniają swoją strukturę 3D i zmieniają fluorescencję cząsteczki, z którą są sprzężone. Innymi wskaźnikami napięcia są zmutowane wersje rodopsyn mikrobiologicznych, fluorescencyjnych cząsteczek, które powodują zmianę napięcia w błonie plazmatycznej w odpowiedzi na światło. Białka te mogą również działać odwrotnie, zmieniając swoją reakcję na światło – a tym samym swoją fluorescencję – w odpowiedzi na zmianę napięcia w błonie.
Wszystko w szczegółach
Do tej pory GEVI okazały się skuteczne w śledzeniu pojedynczych potencjałów czynnościowych zarówno w hodowanych neuronach, wyhodowanych w naczyniu, jak i w nienaruszonych mózgach szerokiej gamy zwierząt, od owadów5 do myszy6. Jedną z największych obietnic tej techniki jest możliwość rejestrowania nie tylko dużych zdarzeń, ale także małych, podprogowych zmian w napięciu membranowym, które odzwierciedlają wiadomości otrzymywane przez neuron z sąsiednich komórek, mówi Cohen. „Obrazowanie napięcia pozwala zobaczyć wejścia do neuronów in vivo, na co wcześniej nie mieliśmy sposobu” – mówi Cohen.
W ciągu ostatniego roku Cohen i jego koledzy opracowali nowe GEVIs i udoskonalili techniki mikroskopowe, aby rejestrować takie podprogowe zmiany napięcia z wielu neuronów jednocześnie, w tym w mózgu myszy7,8. Zespół był również w stanie rejestrować aktywność elektryczną tych samych neuronów aż do tygodnia później. Możliwość dokładnego poznania, które neurony są rejestrowane i śledzenia ich w czasie pozwala badaczom przyjrzeć się okablowaniu pomiędzy tymi neuronami, mówi Ed Boyden, neurobiolog z Massachusetts Institute of Technology w Cambridge. W ten sposób „można powiązać strukturę mózgu z jego funkcją”, mówi. „To jedno z podstawowych pytań w całej neuronauce.”
Inną zaletą GEVI jest to, że w przeciwieństwie do elektrod, które rejestrują głównie sygnały z ciała komórki, mogą one rejestrować sygnały elektryczne z każdej części komórki nerwowej, aż do końcówek dendrytów (patrz 'Uderzenie w skalę’). To tak, jakby móc słuchać nut granych przez lewą rękę pianisty. „To jest coś, o czym marzyłam od dawna – i nie jestem w tym osamotniona” – mówi Katalin Toth, neurobiolog z Uniwersytetu Laval w Quebec City w Kanadzie. Wielu neurobiologów dąży do śledzenia napięcia w całych neuronach, aby zobaczyć, jak zmienia się ono w różnych regionach komórki” – mówi. Wei interesuje się klasą neuronów, które silniej reagują na bodźce wzrokowe, gdy poruszają się w określonym kierunku. Przyglądając się zmianom napięcia błonowego w różnych częściach tych neuronów, ma nadzieję zrozumieć, w jaki sposób komórki sumują przychodzące sygnały, aby wykryć kierunek ruchu.
Neurofizjolog Vincent Villette z Ecole Normale Supérieure w Paryżu planuje wykorzystać czujniki napięcia do zbadania, w jaki sposób regularne fluktuacje podprogowych sygnałów elektrycznych decydują o tym, jak neurony w móżdżku myszy koordynują aktywność mięśni. „Jest wiele do zrozumienia, jak komórki działają razem”, mówi Villette.
Uzyskanie wizualnego odczytu napięcia membrany pozwala naukowcom dostrzec sygnały elektryczne, które hamują odpalanie neuronów, a nie je wyzwalają. Ponieważ sygnały hamujące są niemożliwe do zarejestrowania za pomocą metod takich jak obrazowanie wapnia, nie jest jasne, jak dokładnie kształtują one aktywność mózgu, mówi Rosa Cossart, neurobiolog z Mediterranean Institute of Neurobiology w Marsylii, Francja.
Cossart używa elektrod i obrazowania wapnia od lat, ale teraz jest chętna do wypróbowania GEVIs. Ma nadzieję, że te czujniki pozwolą jej mierzyć napięcie z dużą prędkością w wielu neuronach – co najmniej 50 – w tym samym czasie u żywej myszy. Pomogłoby to zrozumieć, w jaki sposób grupy neuronów integrują sygnały elektryczne – zarówno pobudzające, jak i hamujące – w celu wspierania działań, które są kluczowe dla rozwoju i funkcjonowania mózgu, mówi.
Głębokie wyzwania
Mimo wysokich oczekiwań, doprowadzenie GEVIs do pracy w laboratorium może być kłopotliwe. Weźmy na przykład Helen Yang: jako studentka na kalifornijskim Uniwersytecie Stanforda postanowiła wypróbować GEVI jako sposób na badanie neuronów w układzie wzrokowym muszki owocowej. Ale patrząc przez mikroskop podczas swojego pierwszego eksperymentu, Yang nie zauważyła żadnej zmiany we fluorescencji komórek, nawet gdy błysnęła jasnym światłem w oczy muszki. Dopiero po przeanalizowaniu danych zdała sobie sprawę, że bodźce wzrokowe wytwarzają sygnał, ale jest on bardzo mały. „Byłam bardzo podekscytowana, ale moi koledzy z laboratorium byli mniej”, mówi. „Odpowiedzi były dość małe i głośne.”
Yang zaczęła bawić się ustawieniami mikroskopu, zwiększając moc lasera i przyspieszając obrazowanie. „Zasadniczo sprawiłam, że wszystko działało tak szybko, jak tylko nasz mikroskop mógł” – mówi. To dlatego, że reakcja wskaźnika na sygnał elektryczny była tak szybka, że zmiana fluorescencji była wykrywalna tylko przez ułamek sekundy. „Jeśli uchwycisz tylko jedną klatkę w czasie, gdy komórka reaguje, odpowiedź nie wygląda wcale na dużą” – mówi Yang.
Yang w końcu udało się wykorzystać GEVIs do zbadania, jak neurony muchy przetwarzają wskazówki wizualne5, ale wyzwania, z którymi się zmierzyła, jak dotąd uniemożliwiły obrazowanie napięciowe stanie się techniką powszechną. Jak mówi Cohen, wymaga to zaawansowanych, często specjalnie skonstruowanych platform mikroskopowych. „Nie można tego zrobić na mikroskopie fluorescencyjnym babci”.
W ciągu ostatnich pięciu lat, wsparcie finansowe z inicjatywy BRAIN zwiększyło postępy w tej dziedzinie, w tym rozwój lepszych GEVIs, mówi Michael Lin, inżynier białka w Stanford.
Równolegle z rozwojem nowych czujników, naukowcy pracują nad technikami precyzyjnego obrazowania szybkich sygnałów elektrycznych podróżujących przez mózg. Jednym z wyzwań jest to, że większość dostępnych technik działa dobrze tylko z komórkami w naczyniu lub na powierzchni mózgu. Ale mózg ssaków nie jest przezroczysty: w rzeczywistości wygląda jak tofu, mówi Na Ji, fizyk z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Berkeley.
Aby zajrzeć głębiej, badacze muszą sięgnąć po bardziej inwazyjne metody, takie jak usunięcie części tkanki pokrywającej mózg lub włożenie maleńkich urządzeń optycznych zwanych mikroendoskopami bezpośrednio do mózgu. Alternatywnym, nieinwazyjnym sposobem zaglądania do nieprzezroczystych tkanek – na głębokość do 1 milimetra – jest mikroskopia dwufotonowa. Technika ta wykorzystuje światło o większej długości fali i niższej energii, które może przenikać głębiej do tkanek. Ponieważ mikroskopy dwufotonowe oświetlają i rejestrują obraz tylko z jednego miejsca na raz, rejestrują obrazy zbyt wolno, aby śledzić wiele szybkich ruchów mózgu. Ale specjaliści są pewni, że postępy w technologii wkrótce umożliwią oglądanie sygnałów wytwarzanych przez GEVIs z większą prędkością. „To jest absolutnie wykonalne”, mówi Ji.
Jeśli różne podejścia mogą pokonać te wyzwania, naukowcy nie mają wątpliwości, że obrazowanie napięcia stanie się standardowym podejściem do pomiaru aktywności mózgu. „W następnym roku lub dwóch, zobaczymy wiele prac, które zastosowały czujniki napięcia i dowiedziały się o biologii”, mówi Thomas Clandinin, neurobiolog w Stanford. Niektórzy twierdzą, że technika ta może nawet zastąpić elektrody w przypadku pytań związanych z tym, jak neurony przetwarzają i integrują informacje.