RNase A: Frequently Asked Questions | AG Scientific Blog

Wprowadzenie do RNase

Ribonukleazy (RNases) są dużą grupą enzymów hydrolitycznych, które degradują cząsteczki kwasu rybonukleinowego (RNA). Są to nukleazy, które katalizują rozpad RNA na mniejsze składniki. Stanowią nadrodzinę enzymów, które katalizują degradację RNA, działając na poziomie transkrypcji i translacji.

3D conformation of ribonuclease A enzyme

Ekzymy te są obecne we wszystkich żywych komórkach i płynach biologicznych, w tym u prokariotów i eukariotów, i pełnią wiele ważnych funkcji. RNazy są wszechobecne, mają bardzo krótki czas życia w niechronionym środowisku. Efekty cytotoksyczne obejmują rozszczepianie RNA prowadzące do zahamowania syntezy białek i indukcji apoptozy. Te efekty cytotoksyczne mogą być wytwarzane przez nanoszenie RNazy na zewnętrzną powierzchnię komórki, ale stwierdzono, że cytotoksyczność wzrasta 1000-krotnie, gdy enzym jest sztucznie wprowadzany do cytozolu, co wskazuje na internalizację do wnętrza komórki jako etap ograniczający szybkość działania toksycznego.

RNazy są klasyfikowane jako endoribonukleazy i egzoribonukleazy. Endoribonukleazy to formy A, P, H, I, III, T1, T2, U2, V1, PhyM i V.

Eksoribonukleazy obejmują formy RNaz PH, II, R, D i T, jak również fosforylazę polinukleotydową (PNPase), oligoribonukleazę, egzoribonukleazę I i egzoribonukleazę II. Enzymy te w różny sposób rozszczepiają różne gatunki RNA.

Ostatnio badacze zwrócili uwagę na RNazy jako możliwe środki w leczeniu nowotworów. Chodzi o to, aby znaleźć enzym selektywnie niszczący komórki nowotworowe bez wpływu na otaczające je normalne komórki.

Produkty RNazy A od AG Scientific, Inc.

Najczęściej zadawane pytania dotyczące RNazy A

Co to jest RNaza A?

Ribonukleaza A jest enzymem trawiennym wydzielanym przez trzustkę, który specyficznie „trawi” lub hydrolizuje polimery RNA (ale nie DNA) poprzez endonukleazowe rozszczepianie wiązań fosfodiestrowych tworzących kowalencyjne połączenia między sąsiadującymi resztami rybonukleotydowymi w tych cząsteczkach.

Co oznacza „A” w RNazie A?

„A” w nazwie nie odnosi się do jej specyficzności substratowej, ale do dominującej formy enzymu produkowanego przez trzustkę bydlęcą. RNaza A jest niemodyfikowana, podczas gdy RNaza B, RNaza C i RNaza D są mieszaninami glikoform.

Ponieważ jest dostępna w dużej ilości i wysokiej czystości, RNaza A była przedmiotem przełomowych prac w chemii białek i enzymologii. Ponadto, cytotoksyczne warianty i homologi enzymu wykazały przydatność jako środki chemioterapeutyczne.

Jaka jest historia tego enzymu?

Została wykorzystana przez Christiana Anfinsena do udowodnienia, że sekwencja aminokwasów określa strukturę złożonego białka i została wykorzystana przez Stanforda Moore’a i Williama Steina do wykazania, że specyficzny układ aminokwasów jest wykorzystywany w centrum katalitycznym enzymów.

Ribonukleaza A była również pierwszym enzymem zsyntetyzowanym przez R. Bruce’a Merrifielda, pokazując, że cząsteczki biologiczne są po prostu jednostkami chemicznymi, które można sztucznie skonstruować. Wszystkie te centralne koncepcje, odkryte z pomocą rybonukleazy, zostały nagrodzone Nagrodami Nobla.

Jaka jest struktura RNazy A?

Struktura RNazy

Stosunkowo niewielka, 124 aminokwasowa sekwencja RNazy A, która ma masę cząsteczkową 12 600 Da. zawiera cztery reszty His, dwie z nich His12 i His119 są bezpośrednio implikowane jako reszty katalityczne tego enzymu. Pierścień imidazolowy His12 ma anonimowo niską wartość pK (pK < 6,0), co sugeruje, że musi być zdeprotonowany do katalizy. I odwrotnie, pierścień imidazolowy His119 ma anonimowo wysoką wartość pK (pK > 6.0) sugerującą, że musi być protonowany do katalizy.

Czy rybonukleaza A jest białkiem?

RNaza A jest małym białkiem, dojrzały enzym ma tylko 124 reszty aminokwasowe, bez dołączonego węglowodanu. W przeciwieństwie do innych enzymów RNaza A zawiera 19 z 20 kwasów, brakuje jej tylko tryptofanu.

Jaki jest mechanizm działania?

His12 działa jak ogólna zasada, akceptując proton 2′-OH pierścienia cukrowego rybonukleinowego. Promuje to nukleofilowy atak 2′-OO na bardziej dodatnio naładowany atom fosforu (P), tworząc w ten sposób pośredni fosforan 2′-,3′-cyklicznego rybonukleotydu. Tworzenie tego pośredniego jest ułatwione przez imidazol z His119, który działa jak ogólny kwas, oddając swój proton do atomu tlenu w podatnym wiązaniu P-O-R’.

Dla drugiego kroku reakcji, ogólne aktywności kwasowe i zasadowe łańcuchów bocznych tych dwóch reszt His są odwrócone. His12 działa jako ogólny kwas, oddając swój nowo nabyty proton do 2′-,3′-cyklicznego pośredniego fosforanu rybonukleotydu, podczas gdy His119, który działa jako ogólna zasada, przyjmując proton od wody, aby promować atak hydroksylowy na ten sam 2′-,3′–cykliczny pośredni.

Jakie jest miejsce rozszczepienia RNazy A?

RNaza A wydajnie hydrolizuje zanieczyszczenia RNA w preparatach DNA poprzez rozszczepianie wiązania fosfodiestrowego pomiędzy grupą 3′-fosforanową nukleotydu pirymidynowego (C i U) a 5′-rybozą sąsiedniego nukleotydu 1, 2, 3. Powstały pośredni 2′-,3′–cykliczny fosfodiester jest następnie dalej hydrolizowany do grupy 3′-monofosforanowej. Bydlęca trzustkowa RNaza A jest bardzo stabilnym białkiem o 124 aminokwasach z najwyższą zmierzoną aktywnością wobec jednoniciowego RNA i dwukrotnie szybszym tempem rozszczepiania przy resztach cytydynowych w porównaniu z resztami urydylowymi.

Jaka jest reakcja katalizy kwasowo-zasadowej RNazy A?

RNaza A wykorzystuje również katalizę kwasowo-zasadową do chemicznej zmiany swoich substratów. Kwaśne lub zasadowe reszty enzymu przenoszą protony do lub z reagenta w celu stabilizacji ładunków rozwijających się w stanie przejściowym. Przeniesienie protonów zwykle tworzy lepsze grupy opuszczające, czyniąc reakcję bardziej korzystną energetycznie.

Histydyna jest bardzo powszechną resztą aminokwasową zaangażowaną w katalizę, ponieważ histydyna ma wartość pKa zbliżoną do obojętnej (pKa=6); dlatego histydyna może zarówno przyjmować, jak i oddawać protony w fizjologicznym pH.

Jaka jest stabilność rybonukleazy A?

Rybonukleaza A jest zadziwiająco stabilna. Na przykład, w jednej procedurze oczyszczania rybonukleazy A z trzustki krowy, ekstrakty są traktowane kwasem siarkowym, a następnie podgrzewane prawie do wrzenia, a rybonukleaza A jest jedyną rzeczą, która przeżywa. Nie jest to zaskakujące, ponieważ jest ona wydzielana przez trzustkę i musi wykonywać swoją pracę w niegościnnym środowisku przewodu pokarmowego. Stabilność rybonukleazy A wynika w dużej mierze z czterech wiązań disiarczkowych, które sklejają ze sobą różne części łańcucha.

Ogólnie, w celu zachowania stabilności, należy przechowywać i obchodzić się z produktem zgodnie z instrukcjami sprzedawcy.

Jak inaktywowana jest RNaza A?

RNaza A jest dość stabilnym enzymem i zawiera 4 mostki disiarczkowe, które występują we wszystkich rybonukleazach trzustkowych ssaków. Kiedy mostki te są redukcyjnie zerwane, białko ulega denaturacji i staje się nieaktywne. Po ponownym utlenieniu białko ponownie się składa i przywracana jest pełna aktywność. Możliwa jest jednak tylko częściowa redukcja mostków i zachowanie aktywności enzymu. Usunięcie 4 peptydów na końcu karboksylowym niszczy aktywność enzymu.

Co hamuje RNazę A?

Wanadan urydyny jest silnym inhibitorem kompetycyjnym RNazy A. To, co czyni go tak silnym, to fakt, że jego struktura naśladuje stan przejściowy, który jest pośredni w reakcji.

Jak przygotowuje się RNazę A z zapasu?

RNazę A przygotowuje się zwykle poprzez gotowanie zapasu przez 10 minut w celu wyeliminowania zanieczyszczającej aktywności DNazy bez wpływu na RNazę. Ogrzewanie do 65°C nie wpłynie na RNazę.

Jak odtworzyć przygotowany zapas RNazy A?

RNazę A można rozpuścić w stężeniu od 1 do 10 mg/ml w 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 15 mM NaCl, ogrzewać do 100°C przez 15 minut w celu inaktywacji zanieczyszczających DNaz i powoli schładzać do temperatury pokojowej, a następnie dozować do podwielokrotności.

Jakie jest stężenie robocze tego enzymu?

Zalecane stężenie robocze RNazy A wynosi od 1 do 100 µg/mL w zależności od zastosowania. Enzym jest aktywny w szerokim zakresie warunków reakcji. W niskich stężeniach soli (0 do 100 mM NaCl), RNaza A rozszczepia jednoniciowe i dwuniciowe RNA, jak również nić RNA w hybrydach RNA-DNA.

Jaka jest temperatura przechowywania i sposób obchodzenia się z tym produktem?

Przechowywać w szczelnie zamkniętej fiolce w temperaturze -20ºC. Po otwarciu, odwodnić przez żel krzemionkowy w próżni przed powrotem do -20ºC. Zachować ostrożność przy obchodzeniu się z nim. Nie używać tego związku, jeśli nie jest się w pełni przeszkolonym lub nie jest się świadomym związanych z tym zagrożeń.

Jakie są zastosowania RNazy A?

RNazy odgrywają ważną rolę w degradacji i obrocie RNA we wszystkich organizmach. Enzym rybonukleaza może odwijać helisę RNA poprzez kompleksowanie z jednoniciowym RNA.

RNaza A jest endoribonukleazą z funkcjami w metabolizmie RNA i regulacji ekspresji genów.

RNaza A odgrywa ważną rolę w chorobach takich jak choroby autoimmunologiczne, niewydolność nerek i zaburzenia trzustki. Ostatnio odnotowano również aktywność przeciwnowotworową dla RNazy A o właściwościach cytotoksycznych i cytostatycznych. Członkowie nadrodziny RNase A są szeroko wyrażane i obecne w surowicy i tkankach ssaków.

Ezym może być stosowany do hydrolizy RNA z próbek białek. Jest on zgodny do stosowania w testach ochrony przed RNazą, do usuwania niespecyficznie związanego RNA, w analizie sekwencji RNA, do hydrolizy RNA zawartego w próbkach białek oraz w oczyszczaniu DNA.

Jaki jest wygląd/forma tego produktu?

Dostarczany jako biały, chromatograficznie oczyszczony, wolny od soli, liofilizowany proszek. Wygląd/forma produktu może się różnić w zależności od producenta.

Dodatkowa lektura

• Źródła skażenia DNA w laboratorium
• Tiocyjanian guanidyny w buforach do lizy RNA
• 8 korzyści z wyboru AGS as Your Proteinase K Supplier

.