Test klonogeniczny: co, dlaczego i jak

Test klonogeniczny, znany również jako test tworzenia kolonii

jest testem przeżycia komórek in vitro. Ocenia zdolność pojedynczych komórek do przeżycia i rozmnażania się w celu utworzenia kolonii.1 Test ten został po raz pierwszy opisany w latach 50-tych, gdzie był używany do badania wpływu promieniowania na przeżycie i wzrost komórek nowotworowych, a następnie odegrał istotną rolę w radiobiologii.2

W celu zmierzenia klonogenności, komórki muszą być wysiane w bardzo niskich gęstościach i pozostawione na okres 1-3 tygodni w celu utworzenia kolonii. Kolonie są następnie utrwalane, barwione fioletem krystalicznym, aby były widoczne, i liczone. W celu analizy danych wykreśla się krzywe przeżywalności komórek. Obecnie testy klonogeniczne są wykorzystywane do odpowiedzi na wiele pytań eksperymentalnych, zwłaszcza w biologii nowotworów.

Ten blog podkreśla:

Jak przeprowadzić test klonogenny z ważnymi rozważaniami, które należy poczynić po drodze

Użycie mikroskopii bezetykietowej i detekcji konfluencji do oceny liczby i wielkości kolonii przy użyciu zautomatyzowanej kwantyfikacji obrazu

Test przeżycia klonogennego

Testy klonogenne są szeroko stosowane w dziedzinie badań nad rakiem, ponieważ tworzenie klonów jest interpretowane jako cecha komórek nowotworowych o zdolnościach inicjowania nowotworów. Chociaż to badanie było początkowo stosowane w dziedzinie radiobiologii, stało się standardowym narzędziem w badaniach nad rakiem do oceny wzrostu komórkowego oraz cytotoksycznych lub genotoksycznych skutków różnych czynników o potencjalnym zastosowaniu klinicznym. Obejmuje to środki chemioterapeutyczne oraz terapie celowane na własną rękę lub w połączeniu 3.

Klonogeniczny wzrost jest również wykorzystywany do oceny macierzystości poszczególnych populacji komórek, ponieważ komórki macierzyste są komórkami długo żyjącymi z potencjałem do ciągłej proliferacji. Jest to szczególnie istotne w badaniach nad nowotworami, ponieważ nowotworowe komórki macierzyste są często związane z chemioopornością, powstawaniem wtórnych guzów i nawrotami nowotworów. Dlatego też, badanie macierzystości nowotworu przy użyciu analizy klonogennej jest cennym i szeroko stosowanym narzędziem do przewidywania skuteczności określonej terapii.4

Atesty klonogenne mierzą zdolność komórek do zachowania ich integralności reprodukcyjnej przez dłuższy okres czasu. Jest to ważna cecha, ponieważ ujawnia efekty fenotypowe, które wymagają czasu i prawdopodobnie kilku podziałów komórkowych, aby się rozwinąć. Przy analizie oporności terapeutycznej jest to szczególnie ważne. Oporność na leki nie może być zidentyfikowana przy użyciu krótkoterminowych oznaczeń cytotoksyczności.5

Jak wykonać badanie klonogeniczne

Informacje w tej sekcji zostały zaadaptowane z Franken et al. (2006), którzy opublikowali protokół badania klonogenicznego w Nature Protocols1, w połączeniu z kilkoma spostrzeżeniami z mojego własnego doświadczenia zdobytego podczas wykonywania ponad 60 badań klonogenicznych w trakcie mojego doktoratu.

Podstawowo, istnieją dwa różne sposoby wykonania badania klonogenicznego:

(1) Komórki mogą być wysiewane przy niskich gęstościach, a następnie traktowane w celu zbadania wpływu traktowania na klonogenność komórek.

(2) Komórki mogą być poddawane działaniu substancji przez określony czas, a następnie ponownie wysiewane przy niskich gęstościach w pożywkach nieobjętych działaniem substancji w celu zbadania zdolności klonogennych.

Tradycyjny protokół dla testów klonogenicznych

Ryc. 1 | A summary of a traditional clonogenic protocol where cells are seeded, treated and then clonogenicity assessed.

Clonogenic assays are typically performed in 6-well or 24-well plates. Komórki muszą być rozproszone i równomiernie rozmieszczone, aby mogły powstawać izolowane kolonie. Dlatego ważne jest, aby zoptymalizować gęstość wysiewu dla wybranego rozmiaru studzienki przed wykonaniem testu klonogennego.

Dobrym punktem wyjścia jest sprawdzenie w literaturze czy jakiekolwiek badania przeprowadziły testy klonogeniczne z twoją linią komórkową, a następnie przetestowanie tej gęstości posiewu i dwóch lub trzech innych. Podczas tego procesu optymalizacji, ważne jest również, aby wziąć pod uwagę punkt końcowy eksperymentu (np. 7 dni, 14 dni lub 21 dni) i szybkość wzrostu komórek, ponieważ nie chcemy, aby kolonie połączyły się, co zakłóci kwantyfikację i analizę kolonii. Gęstość posiewu powinna być taka sama dla wszystkich warunków traktowania w twoim eksperymencie.
Używanie właściwych kontroli jest krytyczne dla etapu analizy. Zawsze należy używać kontroli bez traktowania, jak również kontroli tylko z nośnikiem (może to być DMSO, PBS, lub jakikolwiek rozpuszczalnik, w którym rozpuszczane jest traktowanie). Dla warunków traktowania często stosuje się serię rozcieńczeń. Okres traktowania i surowość traktowania pomogą określić zakres stężeń – prawdopodobnie będzie to wymagało pewnej optymalizacji. Każda kontrola i warunek doświadczalny powinny być wykonane w trzech egzemplarzach.

Podczas fazy tworzenia kolonii należy monitorować wzrost kolonii we wszystkich warunkach poddania działaniu substancji. Za kolonię uważa się 50 lub więcej komórek i są one widoczne tylko pod mikroskopem. Ponieważ badanie to jest zwykle przeprowadzane przez długi okres czasu, konieczna będzie zmiana pożywki dla komórek. Na początku komórki będą w bardzo niskiej konfluencji, więc nie trzeba będzie zmieniać pożywki tak regularnie jak zwykle. Jednakże, jeśli posiewasz, a następnie traktujesz lekiem lub związkiem, ważne jest, aby wziąć pod uwagę jego okres półtrwania i dodać świeże leczenie w razie potrzeby.

Dla badaczy, którzy są zainteresowani obrazowaniem wzrostu kolonii w czasie. Polecamy przyjrzenie się CytoSMART Omni.

—————–

Często kolonie w warunkach kontrolnych rosną najszybciej i dlatego można użyć tych komórek jako wskaźnika punktu końcowego eksperymentu, tj. zakończyć eksperyment zanim kolonie zaczną się łączyć, a jeśli dzieje się to zbyt szybko, należy raczej użyć niższej gęstości wysiewu w eksperymencie. Ważne jest, aby zakończyć eksperyment dla wszystkich warunków traktowania w tym samym czasie.

Po osiągnięciu punktu końcowego eksperymentu, komórki muszą być delikatnie przemyte PBS (dodaj PBS z boku studzienki, aby nie zakłócać kolonii), utrwalone i zabarwione barwnikiem interkalującym DNA, fioletem krystalicznym (0,5% w/v) przez co najmniej 30 minut. Usuwanie nadmiaru barwnika może być kłopotliwe. Najlepszą techniką jest delikatne zanurzanie płytek w zlewkach zanurzonych w wodzie, aż cały nadmiar barwnika zostanie usunięty i pozostaną tylko jasnofioletowe kolonie. Zabarwione kolonie można liczyć do 50 tygodni po barwieniu. Zrób wysokiej rozdzielczości zdjęcia swoich studzienek, aby wykorzystać je do analizy, prezentacji i publikacji.

Aby wesprzeć badaczy w analizie i optymalizacji ich testów tworzenia kolonii, CytoSMART wprowadził aplikację dla CytoSMART Omni do wykrywania kolonii w (poklatkowych) obrazach całych płytek studzienkowych przy 10-krotnym powiększeniu. W inkubatorze obrazowanie poklatkowe może dostarczyć informacji kinetycznych, a nie punktów końcowych, co może dostarczyć bardziej szczegółowych informacji o tym, kiedy leczenie zaczyna wpływać na komórki. Bezetykietowa analiza obrazu jest używana do wykrywania kolonii, oceny ich wielkości i okrągłości. Wskaż, kiedy kolonie zaczynają się łączyć i odpowiednio zoptymalizuj.

Jak analizować twoje badanie klonogeniczne

To naprawdę jest tak proste jak ręczne liczenie kolonii dla każdego warunku traktowania i przedstawienie danych jako krzywej przeżycia (powinieneś użyć co najmniej trzech powtórzeń biologicznych dla twojej krzywej).

Krzywa przeżycia wymaga frakcji przeżywającej (SF) komórek poddanych działaniu substancji (obejmuje to stosunek utworzonych kolonii do komórek posianych), która ma być obliczona i wykreślona względem dawki poddania działaniu substancji. Zanim będziesz mógł obliczyć SF, wydajność platerowania (PE) twoich komórek musi być określona, ponieważ różne linie komórkowe mają różne wydajności platerowania i to wpływa na obliczenie frakcji przeżycia.

Ręczne liczenie kolonii jest uciążliwe i może być podatne na błędy, dlatego też opracowano szereg ogólnodostępnych komputerowych narzędzi do szybkiej i obiektywnej analizy obrazów testów klonogennych. Warto wspomnieć o swobodnie dostępnym pakiecie oprogramowania opracowanym przez Brzozowską i wsp. (2019), który nie tylko liczy kolonie, ale także wykreśla ich rozkład wielkości, co stanowi kolejną warstwę przydatnych informacji o zachowaniu komórek (patrz rysunek 2a).6

Alternatywą dla liczenia i ilościowego określania poszczególnych kolonii jest określenie procentu powierzchni studzienki, która jest pokryta przez kolonie (procent powierzchni kolonii) w celu ilościowego określenia wzrostu komórek klonogennych. Guzmán et al. (2014) opracowali wolnodostępną wtyczkę ImageJ o nazwie ColonyArea, która właśnie to robi (patrz rysunek 2b).7Jest to przydatne narzędzie do wykorzystania, jeśli masz połączone kolonie, które są trudne do policzenia wzrokowo lub przez oprogramowanie do liczenia kolonii lub jeśli chcesz szybkiej i wysokiej przepustowości metody analizy.

Ryc. 2 | Wolno dostępne narzędzia do pomiaru testów klonogenicznych. (A) Brzozowska i wsp. opracowali oprogramowanie (countPHICS), które zlicza kolonie i mierzy ich wielkość.6 (B) Guzmán i wsp. opracowali wtyczkę do ImageJ, ColonyArea, która kwantyfikuje obszar wzrostu kolonii i intensywność barwienia.7

Bezznakowy, bez punktu końcowego, półautomatyczny protokół testów klonogenicznych

Ostatnia praca Mayr i wsp. (2018), opisuje nowy i zmodyfikowany protokół testów klonogenicznych, który wykorzystuje 96-dołkowy format mikropłytek i detekcję konfluencji do pomiaru kolonii. Metoda ta umożliwia wszechstronne konfiguracje eksperymentalne przy użyciu 96-dołkowej płytki, jest pozbawiona etykiet, nie ma punktu końcowego barwienia, a analiza jest półautomatyczna (ryc. 3)8. Ponadto, pomiar konfluencji w tej samej studzience bez punktu końcowego, z rozdzielczością czasową, wykazał, że półautomatyczna analiza była odpowiednia do określania liczby kolonii i średniej wielkości.

Figure. 3 | Mayr et al. ocenili wzrost klonogenny w 96 dołkach w czasie przy użyciu detekcji konfluencji8. Wykres pokazuje kwantyfikację wzrostu klonogennego w różnych punktach czasowych, a obrazy pokazują konkretne studzienki z detekcją konfluencji. Zielone plamki reprezentują obszary wykryte przez czytnik konfluencji, a pomarańczowe strzałki wskazują połączone kolonie.

Ta metoda badania klonogennego stanowi efektywną czasowo i kosztowo alternatywę dla standardowego protokołu badania klonogennego. Bez konieczności utrwalania i barwienia punktów końcowych, protokół ten umożliwia ciągłe monitorowanie i analizę wzrostu klonogennego. Ponadto, dodatkowe metryki dotyczące kinetyki wzrostu kolonii mogą być również ekstrahowane podczas eksperymentu. Zminiaturyzowany format otwiera również możliwość testowania drogich terapii, takich jak terapie oparte na siRNA lub CRISPR/Cas9, które nie byłyby wykonalne przy objętości leczenia wymaganej dla płytek 6-dołkowych lub 24-dołkowych. Ostatecznie Mayr i wsp. wykazali, że mikroskopia bezetykietowa z detekcją konfluencji jest solidną i realną opcją do pomiaru klonogenności.

Bezetykietowym, bezkońcowym i zautomatyzowanym rozwiązaniem dla twoich testów klonogennych jest CytoSMART Omni z jego algorytmem wykrywania kolonii. Tworzenie kolonii jest mierzone w czasie w całej studzience z odczytami liczby kolonii, ich wielkości i okrągłości. Twoje komórki nie muszą opuszczać inkubatora, a informacje o kinetyce komórkowej podczas procesu tworzenia kolonii mogą być uzyskane (rys. 4).

Ryc. 4 | Zautomatyzowane wykrywanie kolonii przy użyciu urządzenia CytoSMART Omni. Komórki raka wątroby HEP-G2 na płytce 24-dołkowej były obrazowane przez 75 godzin przy użyciu urządzenia CytoSMART Omni, umieszczonego w standardowym inkubatorze CO2. Obraz przedstawia pełną studzienkę po uruchomieniu algorytmu wykrywania kolonii z klastrami komórek wyróżnionymi przez pomarańczową maskę kolonii. Liczba kolonii, rozmiar i okrągłość były mierzone przez cały czas trwania badania i pokazane na wykresach.

Dowiedz się więcej o wszystkich rozwiązaniach CytoSMART do obrazowania tutaj

.