Verhoeff-Van Gieson (VVG) Staining Protocol for Elastic Fibers
NovaUltra Special Stain Kits
Opis: Metoda ta jest używana do identyfikacji włókien elastycznych w tkankach takich jak skóra, aorta, itp. na sekcjach utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie i może być również stosowana do sekcji mrożonych. Włókna elastyczne będą zabarwione na niebiesko-czarno, a tło na żółto.
Utrwalanie:10% formalina.
Sekcja: przekroje parafinowe w 5 um.
Roztwory i odczynniki:
5% alkoholowa hematoksylina:
Hematoksylina ———————————- 5 g
100% alkohol ———————————- 100 ml
Wymieszać do rozpuszczenia przy pomocy delikatnego ciepła. Przefiltrować.
10% wodny chlorek żelazowy (przygotować świeży, nie jest konieczny):
Chlorek żelazowy ——————————– 10 g
Woda destylowana ——————————– 100 ml
Roztwór jodu Weigerta:
Jodek potasu —————————— 2 g
Jodyna ——————————————- 1 g
Woda destylowana ——————————— 100 ml
Do rozpuszczenia jodku potasu należy użyć 4 ml wody destylowanej. Następnie dodać jodynę. Po rozpuszczeniu jodu, rozcieńczyć ten roztwór przez dodanie 96 ml wody destylowanej. Roztwór ten może być przygotowany świeży w miarę potrzeb lub sporządzony w większych ilościach i przechowywany w brązowej butelce w ciemności w temperaturze pokojowej.
Roztwór roboczy Verhoeffa:
Roztwór roboczy do barwienia powinien być sporządzony na świeżo dla uzyskania najlepszych wyników. Nie zabarwi się on zadowalająco, jeżeli będzie przechowywany dłużej niż jeden dzień roboczy. Przygotować roztwór roboczy przez dodanie w kolejności następujących odczynników:
5% alkoholowa hematoksylina ——————– 20 ml
10% chlorek żelazowy —————————- 8 ml
roztwór jodyny Weigerta ——————- 8 ml
Dobrze wymieszać powyższe ilości (lub ich potrzebne proporcje). Roztwór powinien być jet czarny. Zużyć natychmiast, a po użyciu wyrzucić.
2% wodny chlorek żelazowy (przygotować świeży, nie jest konieczny):
10% chlorek żelazowy z powyższego ———— 10 ml
Woda destylowana ——————————- 50 ml
5% wodny tiosiarczan sodu:
Barwnik Van Giesona:
1% wodny kwas fuksynowy ——————— 5 ml
Nasycony wodny kwas pikrynowy ————– 100 ml
Dla tkanek nerwowych może być przygotowany w następujący sposób:
1% wodny kwas fuksynowy ——————- 15 ml
Nasycony wodny kwas pikrynowy ————- 50 ml
Woda destylowana ——————————- 50 ml
Postępowanie:
1. Deparafinować i uwodnić szkiełka do wody destylowanej.
2. Barwić w roztworze Verhoeffa przez 1 godzinę. Tkanka powinna być całkowicie czarna.
3. Wypłukać w wodzie z kranu z 2-3 zmianami.
4. Różnicować w 2% chlorku żelazowym przez 1-2 min.
5. Przerwać różnicowanie kilkoma zmianami wody wodociągowej i sprawdzić mikroskopowo, czy nie ma czarnego zabarwienia włókien elastycznych i szarego tła. Lepiej jest lekko niedostatecznie zróżnicować tkankę, ponieważ późniejsza kontrbarwa Van Giesona może nieco wyodrębnić barwę elastyczną.
6. przemyć szkiełka w wodzie z kranu.
7. poddać działaniu 5% tiosiarczanu sodu przez 1 minutę. Wyrzucić roztwór.
8. Płukać w bieżącej wodzie z kranu przez 5 minut.
9. Kontarstain w roztworze Van Giesona przez 3-5 min.
10. Szybko odwodnić w 95% alkoholu, 2 zmiany 100% alkoholu.
11. Klarować w 2 zmianach ksylenu przez 3 minuty każda.
12. Przykryć szkiełkiem nakrywkowym z żywicznym medium montażowym.