RNază A: Întrebări frecvente | AG Scientific Blog

Introducere la RNază

Ribonucleazele (RNaze) sunt un grup mare de enzime hidrolitice care degradează moleculele de acid ribonucleic (ARN). Acestea sunt nucleaze care catalizează descompunerea ARN-ului în componente mai mici. Ele reprezintă o superfamilie de enzime care catalizează degradarea ARN-ului, acționând la nivelul transcripției și al traducerii.

Conformarea 3D a enzimei ribonucleaza A

Aceste enzime sunt prezente în toate celulele vii și fluidele biologice, inclusiv în procariote și eucariote, și îndeplinesc multe funcții importante. RNazele sunt omniprezente, cu o durată de viață foarte scurtă într-un mediu neprotejat. Efectele citotoxice includ scindarea ARN-ului, ceea ce duce la inhibarea sintezei proteinelor și la inducerea apoptozei. Aceste efecte citotoxice pot fi produse prin aplicarea de RNază pe suprafața exterioară a celulei, dar s-a constatat că citotoxicitatea crește de 1000 de ori atunci când enzima este introdusă în mod artificial în citosol, ceea ce indică internalizarea în celulă ca fiind pasul care limitează rata de toxicitate.

RNazele sunt clasificate ca endoribonucleaze și exoribonucleaze. Endoribonucleazele sunt formele A, P, H, I, III, T1, T2, U2, V1, PhyM și V.

Exoribonucleazele includ formele de RNază PH, II, R, D și T, precum și polinucleotide fosforilază (PNPază), oligoribonuclează, exoribonuclează I și exoribonuclează II. Aceste enzime clivează în mod diferit diverse specii de ARN.

Recent, cercetătorii au acordat atenție RNazelor ca posibili agenți pentru tratamentul cancerului. Ideea este de a găsi o enzimă care să dăuneze selectiv celulelor canceroase fără a afecta celulele normale din jur.

Produsele RNase A de la AG Scientific, Inc.

Întrebări frecvente despre RNase A

Ce este RNase A?

Ribonucleaza A este o enzimă digestivă secretată de pancreas care „digeră” sau hidrolizează în mod specific polimerii de ARN (dar nu și de ADN) prin clivarea endonucleasică a legăturilor fosfodiesterice care formează legăturile covalente dintre reziduurile ribonucleotidice adiacente din aceste molecule.

Ce înseamnă „A” în RNază A?

„A” din denumirea sa nu se referă la specificitatea substratului său, ci la forma predominantă a enzimei produsă de pancreasul bovin. RNaza A este nemodificată, în timp ce RNaza B, RNaza C și RNaza D sunt amestecuri de glicoforme.

Datorită disponibilității sale în cantitate mare și purității ridicate, RNaza A a făcut obiectul unor lucrări de referință în chimia proteinelor și enzimologie. În plus, variantele citotoxice și omologii enzimei și-au demonstrat utilitatea ca agenți chimioterapeutici.

Care este istoria acestei enzime?

A fost folosită de Christian Anfinsen pentru a dovedi că secvența de aminoacizi, determină structura unei proteine pliate și a fost folosită de Stanford Moore și William Stein pentru a demonstra că un aranjament specific de aminoacizi este folosit în centrul catalitic al enzimelor.

Ribonucleaza A a fost, de asemenea, prima enzimă sintetizată de R. Bruce Merrifield, demonstrând că moleculele biologice sunt pur și simplu entități chimice care pot fi construite în mod artificial. Toate aceste concepte centrale, descoperite cu ajutorul ribonucleazei, au fost recompensate cu premii Nobel.

Care este structura RNazei A?

Structura RNazei

Secvența relativ mică, de 124 de aminoacizi a RNazei A, care are o masă moleculară de 12.600 Da. conține patru reziduuri His, două dintre reziduurile His12 și His119 sunt direct implicate ca reziduuri catalitice ale acestei enzime. Inelul imidazol al His12 are o valoare pK anonimă scăzută (pK < 6,0), sugerând că trebuie să fie deprotonat pentru cataliză. În schimb, inelul imidazol din His119 are o valoare pK anonimă ridicată (pK > 6,0), ceea ce sugerează că trebuie să fie protonat pentru cataliză.

Ribonucleaza A este o proteină?

RNaza A este o proteină mică, enzima matură are doar 124 de resturi de aminoacizi, fără carbohidrați atașați. Spre deosebire de alte enzime, RNaza A conține 19 din cei 20 de acizi, lipsind doar triptofanul.

Care este mecanismul de acțiune?

His12 acționează ca o bază generală, acceptând protonul 2′-OH al inelului de zahăr ribonucleic sesilic. Acest lucru favorizează un atac nucleofilic al 2′-O asupra atomului de fosfor (P) mai încărcat pozitiv, creând astfel un intermediar fosfat de ribonucleotidă 2′-,3′-ciclică. Crearea acestui intermediar este facilitată de imidazolul din His119 care acționează ca un acid general, donând protonul său atomului de oxigen în legătura P-O-R’ sensibilă.

Pentru a doua etapă a reacției, activitățile generale de acid și de bază ale catenelor laterale ale acestor două reziduuri His sunt inversate. His12 acționează ca un acid general, donând protonul său nou dobândit către intermediarul fosfat de ribonucleotidă 2′-,3′-ciclică, în timp ce His119 care acționează ca o bază generală, acceptând un proton de la apă pentru a favoriza atacul hidroxilului asupra aceluiași intermediar 2′-,3′-ciclic.

Care este situsul de clivaj al RNazei A?

RNaza A hidrolizează eficient contaminanții ARN din preparatele de ADN prin clivarea legăturii fosfodiester dintre gruparea 3′-fosfat a unei nucleotide pirimidinice (C și U) și 5′-riboza nucleotidei adiacente 1, 2, 3. Fosfodiesterul intermediar 2′-,3′-ciclic care este generat este apoi hidrolizat în continuare la o grupare 3′-monofosfat. RNaza A pancreatică bovină este o proteină foarte stabilă de 124 de aminoacizi, cu cea mai mare activitate măsurată față de ARN monocatenar și cu o rată de scindare de două ori mai rapidă la reziduurile de citodină în comparație cu reziduurile de uridil.

Ce este reacția de cataliză acidă/bază a RNazei A?

RNaza A folosește, de asemenea, cataliza acidă/bază pentru a-și modifica chimic substraturile. Reziduurile acide sau bazice ale enzimei transferă protoni către sau de la reactant pentru a stabiliza sarcinile în dezvoltare în starea de tranziție. Transferul de protoni creează, de obicei, grupuri de plecare mai bune, ceea ce face ca reacția să fie mai favorabilă din punct de vedere energetic.

Histidina este un reziduu de aminoacid foarte frecvent implicat în cataliză, deoarece histidina are o valoare pKa apropiată de cea neutră, (pKa=6); prin urmare, histidina poate atât accepta cât și dona protoni la pH fiziologic.

Care este stabilitatea Ribonucleazei A?

Ribonucleazei A este uimitor de stabilă. De exemplu, într-o procedură de purificare a ribonuclazei A din pancreasul de vacă, extractele sunt tratate cu acid sulfuric și apoi încălzite aproape până la fierbere, iar ribonuclaza A este singurul lucru care supraviețuiește. Acest lucru nu este surprinzător, deoarece este secretată de pancreas și trebuie să își îndeplinească funcția în mediul neospitalier al tractului digestiv. Stabilitatea ribonucleazei A se datorează în mare parte celor patru legături disulfidice care lipesc între ele diferite părți ale lanțului.

În general, pentru a menține stabilitatea, depozitați și manipulați produsul în conformitate cu instrucțiunile vânzătorului.

Cum se inactivează RNaza A?

RNaza A este o enzimă destul de stabilă și conține 4 punți disulfidice, care apar în toate ribonucleazele pancreatice de mamifere. Atunci când punțile sunt rupte reductiv, proteina este denaturată și devine inactivă. La reoxidare, proteina se refulează și activitatea completă este restabilită. Cu toate acestea, este posibil să se reducă doar parțial punțile și să se păstreze activitatea enzimatică. Îndepărtarea a 4 peptide de la extremitatea carboxil terminală distruge activitatea enzimei.

Ce inhibă RNaza A?

Vanadatul de uridină este un puternic inhibitor competitiv al RNazei A. Ceea ce îl face atât de puternic este faptul că structura sa imită o stare de tranziție care este intermediară în reacție.

Cum se prepară RNaza A din stoc?

RNaza A se prepară de obicei prin fierberea stocului timp de 10 minute pentru a elimina activitatea DNazei contaminante fără a afecta RNaza. Încălzirea la 65°C nu va afecta RNazele.

Cum se reconstituie stocul preparat de RNază A?

RNaza A poate fi dizolvată la o concentrație de 1 până la 10 mg/ml în Tris-HCl 10 mM, pH 7.5, 15 mM NaCl, se încălzește la 100°C timp de 15 minute pentru a inactiva N-dazele contaminante și se răcește încet la temperatura camerei și se distribuie în părți alicotate.

Care este concentrația de lucru a acestei enzime?

Concentrația de lucru recomandată a RNazei A este de 1 până la 100 µg/mL în funcție de aplicație. Enzima este activă într-o gamă largă de condiții de reacție. La concentrații scăzute de sare (de la 0 la 100 mM NaCl), RNază A scindează ARN monocatenar și bicatenar, precum și șirul de ARN din hibrizii ARN-ADN.

Care este temperatura de păstrare și măsurile de manipulare pentru acest produs?

Să se păstreze în flacon bine închis la -20ºC. Odată deschis, deshidratați-l pe silicagel sub vid înainte de a-l readuce la -20ºC. Aveți grijă la manipulare. Nu utilizați acest compus dacă nu sunteți pe deplin instruit sau dacă nu sunteți conștient de pericolele implicate.

Care sunt aplicațiile RNazei A?

Rnazele au roluri importante în degradarea și reînnoirea ARN-ului în toate organismele. Enzima ribonuclează poate derula helixul de ARN prin complexarea cu ARN monocatenar.

RNaza A este o endoribonuclează cu funcții în metabolismul ARN și în reglarea expresiei genice.

S-a constatat că RNaza A joacă roluri importante în boli precum bolile autoimune, insuficiențele renale și afecțiunile pancreasului. Mai recent, a fost raportată și o activitate anti-tumorală pentru o RNază A cu proprietăți citotoxice și citostatice. Membrii superfamiliei RNazei A sunt exprimați pe scară largă și prezenți în serul și țesuturile mamiferelor.

Enzima poate fi utilizată pentru a hidroliza ARN din probe de proteine. Este compatibilă pentru a fi utilizată în testele de protecție cu RNază, pentru a elimina ARN-ul legat nespecific, în analiza secvențelor de ARN, pentru a hidroliza ARN-ul conținut în probele de proteine și în purificarea ADN.

Care este aspectul/forma acestui produs?

Se livrează sub formă de pulbere albă, purificată cromatografic, purificată prin salinitate, liofilizată. Aspectul/forma produsului poate varia în funcție de producător.

Lectură suplimentară

• Surse de contaminare a ADN-ului în laborator
• Tiocianat de guanidină în soluții tampon de liză pentru ARN
• 8 Beneficii ale alegerii AGS ca furnizor de proteinază K

.