Instrument și reactivi
Instrumentul pentru detectarea MTX a fost Siemens VIVA-E care permite personalizarea parametrilor prin disponibilitatea canalului deschis. Reactivii și calibratorii MTX au fost achiziționați de la Siemens (6L119UL).
Trei niveluri de material de control al calității (QC) au fost achiziționate de la Bio-Rad (Irvine, CA), un material QC personalizat suplimentar la 0,05 μmol/L de la Aladdin (Shanghai, China).
Compararea metodei MTX a fost efectuată prin analizarea acelorași probe folosind testul de cromatografie lichidă-tandem cu spectrometrie de masă (LC-MS/MS) (cromatografie lichidă LC-20 AD și spectrometre de masă AB SCIEX QTRAP®4500).
Specimeni
Probele de test au fost obținute de la secția de hematologie a spitalului de copii din Dalian. Unele probe testate și probe de plasmă icterică fără MTX au fost colectate pentru a studia interferența trigliceridelor și a bilirubinei. Nu s-a intervenit în tratamentul pacienților și nu a fost menționată nicio informație individuală a pacienților.
Prepararea reactivilor
Kit-ul de reactivi Siemens conține reactiv anticorp/substrat A, reactiv enzimatic B, concentrat tampon de dozare a medicamentelor Emit și calibratori de metotrexat Emit. Reactivii A și B au fost reconstituiți cu 3,0 ml de apă deionizată, amestecați prin agitare ușoară și echilibrați la temperatura camerei timp de 1 h. Concentratul tampon MTX a fost amestecat cu apă deionizată (1:15 v/v). Soluția de lucru a reactivilor A și B a fost preparată prin diluarea soluțiilor stoc 1:9 v/v cu soluție tampon.
Câțiva calibratori (0, 0,20, 0,50, 0,50, 1,00 μmol/L) au fost reconstituiți la concentrația indicată cu 1.0 ml de apă deionizată în conformitate cu instrucțiunile producătorului, alți calibratori 1,50 și 2,00 μmol/L au fost reconstituiți la 1,00 μmol/L cu 1,50 și, respectiv, 2,00 ml de apă deionizată. Apoi, calibratorul de 0,20 μmol/L a fost diluat în 0,05 μmol/L, iar cel de 1,00 μmol/L a fost diluat în 0,10 și 0,25 μmol/L. Noul set de calibratori (0, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50 și 1,00 μmol/L) îndeplinește cerințele curbei de calibrare modificate.
Programarea instrumentului Viva-E
Un canal deschis pe Viva-E a fost programat pentru a schimba volumele reactivilor A & B de la 180 μL la 110 μL (110 μL este limita inferioară a Viva-E pentru reactivii MTX). S-a programat o curbă de calibrare în șase puncte cu regresie spline cubică modificată. Cei șase calibratori furnizați de kit au fost 0, 0,20, 0,50, 1,00, 1,50 și 2,00 μmol/L. Atunci când volumele de reactivi A și B au fost reduse, acestea nu au fost suficiente pentru a reacționa cu probe mai mari de 1 μmol/L. Ca urmare, noul set de calibrator al testului EMIT modificat a fost schimbat la 0, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 μmol/L într-un interval de la 0,05 la 1,00 μmol/L.
În conformitate cu instrucțiunile kitului comercial, probele cu o concentrație mai mare de 1,00 μmol/L trebuie diluate în domeniul de aplicare al curbei de calibrare (0.05-1,00 μmol/L) folosind un factor de diluție de 10, 100 sau 1000.
Limita de alb, limita de detecție, limita de cuantificare
Limita de alb (LOB), limita de detecție (LOD), limita de cuantificare (LOQ) au fost determinate în conformitate cu CLSI EP17-A . LOB a fost testat folosind șase probe (S1-S6, 10 repetiții pe parcursul a 10 zile): S1 și S2 au fost calibratori zero din două loturi diferite de calibratori, S3 și S4 au fost diluanți, iar S5 și S6 au fost plasmă albă. LOD a fost testat cu 5 loturi de probe de nivel scăzut, variind de la LOB până la de patru ori LOB (12 replici pe parcursul a 12 zile). LOB și LOD au fost determinate de două loturi de reactivi. În conformitate cu cerințele clinice, obiectivul pentru eroarea totală a fost stabilit la 20%. Rezultatele testelor din studiul LOD au fost utilizate pentru a estima distorsiunea și imprecizia pentru fiecare nivel al analitului. Apoi, aceste date au fost combinate pentru a estima eroarea totală la fiecare nivel și pentru a determina limita de cuantificare (LOQ).
Imprecizia intrazilnică și interzilnică
Imprecizia intrazilnică (n = 10) a testului modificat a fost evaluată prin intermediul unui nivel de materiale de control (0,05 μmol/L) și a trei niveluri de probe de pacienți (0,12, 0,43, 0,82 μmol/L). La fiecare nivel, au fost efectuate 10 repetiții. Imprecizia interjurnală (n = 25) a fost testată la aceste 4 niveluri în 5 zile consecutive și 5 replici pentru fiecare nivel. Toate probele au fost obținute de la pacienți diferiți. Rezultatele măsurate au fost reprezentate grafic față de valorile așteptate.
Liniaritate
Liniaritatea a fost verificată prin diluarea controlului de calitate de 2,00 μmol/L (hc) cu tampon (c0) în următoarele raporturi: 1hc + 1c0 (1,00 μmol/L), 2hc + 3c0 (0,80 μmol/L), 1hc + 2co (0,67 μmol/L), 1hc + 3co (0,67 μmol/L), 1hc + 3co (0.50 μmol/L), 1hc + 5co (0,33 μmol/L), 1hc + 9co (0,20 μmol/L), 1hc + 19co (0,10 μmol/L), 1hc + 39co (0,05 μmol/L). Fiecare diluție a fost analizată de trei ori, ecuația de liniaritate a analizei modificate a fost calculată pe baza mediilor rezultatelor măsurate și a valorilor așteptate.
Procedura de analiză LC-MS/MS
Procedura de analiză LC-MS/MS efectuată în acest studiu este după cum urmează. Difenhidramina a fost utilizată ca standard intern. Acetonitrilul a fost utilizat ca precipitant seric pentru a elimina albumina. Pentru separările LC s-a folosit o coloană Hypersil ODS-BP C18 (5 μm, 2,1 × 150 mm). Faza mobilă a fost acid formic 0,1% și acetonitril. Eluția în gradient a fost efectuată la un debit de 0,5 ml/min la 30 °C. Modul de monitorizare a reacțiilor multiple (MRM) a fost utilizat pentru a detecta MTX și difenhidramina în sursa de ionizare prin electrospray (ESI) și în modul de scanare a ionilor pozitivi. MTX a fost detectat la m/z 455,0 → 308,1, difenhidramină a fost detectată la m/z 256,0 → 167,0 .
Compararea metodelor
Saptezeci și nouă de probe au fost colectate de la pacienți cu leucemie limfoblastică acută din secția de hematologie a spitalului pentru copii din Dalian. Fiecare eșantion a fost testat utilizând testul EMIT modificat și, respectiv, testul LC-MS/MS. Rezultatele au fost comparate cu ajutorul unei analize de regresie liniară simplă (MedCalc Statistical Software versiunea 15.6.1). Alte 45 de probe au fost testate utilizând testul EMIT modificat și testul EMIT comercial pentru compararea metodei .
Studii de interferență
Interferența trigliceridelor a fost evaluată prin prepararea probelor cu Intralipid (20% emulsie de grăsime IV). Concentrația de trigliceride din probe a fost de 1000 ng/dL. Apoi s-a efectuat testul Paired-T.
Interferența bilirubinei a fost simulată folosind unele probe de plasmă icterică fără MTX cu o concentrație de bilirubină nu mai mică de 30 mg/dL.
Interferența provocată de metabolitul 7-hidroxi-metotrexat, înrudit structural, a fost evaluată prin adăugarea unor niveluri diferite de 7-hidroxi-metotrexat în probele de plasmă, concentrația de MTX în aceste probe fiind de 0,05 μmoL/L. Iar rezultatele testelor din probele curente au fost comparate cu rezultatele probelor originale .