Biotinilarea eficientă și purificarea într-o singură etapă a factorilor de transcripție marcați în celule de mamifere și șoareci transgenici

Rezultate

Biotinilarea eficientă a GATA-1 marcat în celule transfectate. Schema pentru biotinilarea specifică in vivo a proteinelor marcate în celule de mamifere este prezentată în Fig. 1A. În conformitate cu această procedură, o etichetă peptidică mică (23 aa) este fuzionată la proteina de interes și coexprimată în celule împreună cu BirA, o proteină-biotin ligază bacteriană (20). Eticheta peptidică utilizată a fost izolată anterior dintr-o bibliotecă de peptide sintetice examinată pentru biotinilarea mediată de BirA, care are loc în mod specific la reziduul de lizină al etichetei (16). Căutările în bazele de date de proteine nu au identificat nicio proteină naturală care să posede un motiv de secvență similar cu cel al etichetei peptidice.

Proteina pe care am marcat-o la testarea acestui sistem a fost factorul de transcripție hematopoietic murin esențial GATA-1 (pentru o analiză, a se vedea ref. 25). Eticheta a fost fuzionată N-terminal cu GATA-1 și a fost exprimată sub controlul unei casete de expresie a β-globinei umane în celule MEL, care pot fi induse să sufere diferențierea celulelor eritroide terminale (22). BirA a fost, de asemenea, clonată și exprimată în celule MEL prin utilizarea casetei de expresie a globinei umane. Au fost izolate clonele care corespund unor transfectanți singuri și dubli stabili pentru GATA-1 și BirA marcate și au fost inițial analizate pentru exprimarea ambelor construcții. În cazul GATA-1, analiza Western blot cu ajutorul unui anticorp GATA-1 detectează proteina marcată cu migrare mai lentă, precum și GATA-1 endogenă în extractele nucleare din celulele transfectate (Fig. 1B, benzile 1 și 2). Expresia BirA a fost analizată la nivel de ARN (datele nu sunt prezentate).

Am testat apoi, pe transfectanți stabili selectați, dacă proteina GATA-1 marcată a fost biotinilată de BirA. Testarea extractelor nucleare din clonele de celule MEL cu ajutorul unui conjugat streptavidină-HRP a arătat un semnal robust corespunzător proteinei GATA-1 marcate, detectabil doar în culoarul transfectantului dublu GATA-1/BirA marcat (Fig. 1B, culoarul 5). Nu este vizibilă nicio biotinilare a GATA-1 marcată în absența BirA (Fig. 1B, banda 6). Aceste constatări confirmă faptul că proteina BirA este sintetizată într-o formă activă în celulele MEL transfectate. În plus, se observă foarte puțină biotinilare nespecifică de fond în extractele nucleare ale celulelor MEL care exprimă doar BirA (Fig. 1B, banda 7). Prin urmare, concluzionăm că expresia proteinei bacteriene BirA proteină-biotin ligază în celulele MEL poate biotinatiliza în mod specific un factor de transcripție de mamifere purtând un marcaj peptidic unic.

Am testat apoi eficiența biotinatilării prin legarea GATA-1 marcat în extractele nucleare brute la Dynabeads paramagnetice de streptavidină (Fig. 1C). Analiza materialului eluat de pe microsfere a arătat că aproape toată proteina GATA-1 marcată a fost legată (comparați banda 2 cu benzile 1 și 3, Fig. 1C). Reprobarea aceluiași filtru cu streptavidină-HRP arată o eficiență de ≈100 % în ceea ce privește biotinilarea și capturarea GATA-1 marcată de către bile (Fig. 1C, benzile 4 și 5). În plus, în concordanță cu ceea ce s-a observat în Fig. 1B, există o legare de fond redusă a proteinelor biotinilate endogene la margele, așa cum a fost detectată cu streptavidină-HRP (Fig. 1C, banda 5). Aceste date demonstrează că GATA-1 marcată este foarte eficient biotinilată și recuperată din extracte prin legare la streptavidină, cu o biotinilare de fond neglijabilă.

Purificarea într-o singură etapă a GATA-1 biotinilată din extracte nucleare brute prin legare la streptavidină. Am explorat, de asemenea, fezabilitatea unei purificări într-o singură etapă în izolarea GATA-1 biotinilat din extractele nucleare brute prin legarea directă la margele de streptavidină în condiții de stringență moderată (150 mM NaCl/0,3% Nonidet P-40/200 ng/μl albumină de ser de pui). Am încercat mai întâi o legare de control din 5 mg de extracte nucleare brute din celule MEL care exprimă doar BirA (Fig. 2, banda 4). Materialul eluat a constat din aproximativ cinci benzi puternic colorate pe un fundal de benzi mult mai slabe (Fig. 2, banda 5). Am identificat proteinele de legare de fond prin extirparea întregii benzi de pe gel și analizarea acesteia prin cromatografie lichidă-tandem MS. Proteinele astfel identificate sunt clasificate în tabelul 1 în funcție de funcția biologică și de compartimentul celular, așa cum sunt definite de Gene Ontology Consortium (www.geneontology.org). Rezultatele au arătat că cele mai abundente proteine de fond identificate au fost carboxilazele biotinilate natural și enzimele asociate, care au coincis în mare măsură cu benzile intens colorate. Am constatat, de asemenea, legarea de fond a unor proteine nucleare abundente implicate în procesarea ARNm, cum ar fi factorii de splicing, precum și a proteinelor ribozomiale. Împreună, aceste trei clase de proteine au reprezentat >80% din legarea de fond în condițiile utilizate (tabelul 1). Este de remarcat faptul că foarte puține peptide au fost identificate ca corespunzând unor factori implicați în reglarea transcripțională (tabelul 1). Concluzionăm că legarea de fond la margele de streptavidină se datorează în principal proteinelor biotinilate endogene, precum și factorilor nucleari abundenți implicați în procesarea ARNm și în sinteza și asamblarea ribozomilor, cu foarte puțină legare nespecifică a factorilor implicați în reglarea/activarea transcripției.

Am încercat apoi să legăm o cantitate similară de extract nuclear brut (5 mg) de la transfectanți dubli GATA-1/BirA marcați, în aceleași condiții (Fig. 2, banda 2). Modelul de colorare al benzii cu materialul eluat (Fig. 2, banda 3) a fost semnificativ diferit de cel observat cu legarea de fond în banda 5, indicând o îmbogățire semnificativă a proteinelor care se coeluzionează cu GATA-1 marcată (Fig. 2, banda 3 față de banda 5). Este posibil ca GATA-1 biotinilat și proteinele coeluate să se dilueze sau să concureze pentru legare cu proteinele nespecifice observate în banda 5. Astfel, îmbogățirea proteică vizibilă în banda 3 poate corespunde proteinelor care interacționează cu GATA-1 copurificate. În materialul eluat, am observat, de asemenea, o bandă puternic colorată care migrează cu o dimensiune similară cu cea așteptată pentru GATA-1 marcată (figura 2, săgeată, banda 3). Am confirmat prezența GATA-1 în această bandă prin excizia gelului și MS. Analiza detaliată a tuturor proteinelor care copurizează cu GATA-1 marcat va fi publicată în altă parte (P.R., F.G. și J.S., rezultate nepublicate). Luate împreună, aceste date demonstrează biotinilarea cantitativă a GATA-1 marcată în celulele MEL și purificarea eficientă a acesteia din extractele proteice brute printr-o procedură într-o singură etapă prin legare directă la margele de streptavidină, cu puține benzi de legare de fond care corespund în principal proteinelor biotinilate endogene și proteinelor nucleare/nucleolare abundente ușor de identificat.

Biotinilarea nu afectează proprietățile de interacțiune cu proteinele sau de legare la ADN ale GATA-1. Deoarece este posibil ca adăugarea marcajului peptidic și/sau biotinilarea să afecteze proprietățile proteinei marcate, am testat dacă GATA-1 biotinilată ar putea în continuare să realizeze interacțiuni proteină-proteină cu un partener cunoscut al GATA-1, cum ar fi FOG-1 (26), și dacă s-ar putea lega in vivo de ținte cunoscute ale genei GATA-1, cum ar fi promotorul globinei βmaj de șoarece. Am efectuat un experiment de tragere în jos a GATA-1 biotinilat prin legarea extractelor nucleare la bile de streptavidină și am testat dacă FOG-1 a fost, de asemenea, copurificat. Am constatat că FOG-1 a fost tras în jos din extractele care exprimă GATA-1 biotinilat, dar nu și din extractele care exprimă doar BirA (Fig. 3A, benzile 2 și 4). Am constatat, de asemenea, că FOG-1 se copurizează cu GATA-1 biotinilat prin MS. Am efectuat, de asemenea, un experiment de extracție a cromatinei (ChIP) în care cromatina sonicată din celule MEL reticulate cu formaldehidă a fost incubată cu perle de streptavidină, urmată de eluția materialului legat și recuperarea ADN-ului extras. Utilizând primeri specifici pentru promotorul βmaj, am constatat o îmbogățire pentru aceste secvențe în ADN-ul extras din cromatina celulelor care exprimă GATA-1 biotinilat, dar nu și din celulele care exprimă BirA (Fig. 3B). Am constatat, de asemenea, că biotinilarea nu afectează distribuția subnucleară observată în mod normal cu GATA-1 (Fig. 5, care este publicată ca informație de sprijin pe site-ul web PNAS; ref. 27) și că GATA-1 biotinilată prezintă un profil de fracționare biochimică identic cu GATA-1 endogenă în extractele nucleare ale celulelor MEL (datele nu sunt prezentate). Luate împreună, aceste rezultate oferă dovezi solide că proprietățile GATA-1 nu sunt afectate de marcarea prin biotinilare. În plus, aceste date demonstrează, de asemenea, aplicarea marcării prin biotinilare ca o alternativă la anticorpi în metodele care implică o etapă de purificare prin afinitate, cum ar fi extracția de proteine sau un test ChIP.

Biotinilare prin marcare la șoareci transgenici. Capacitatea de a izola direct proteina marcată cu biotină din extractele brute într-o singură etapă ridică perspectiva utilizării acestei abordări în purificarea proteinelor marcate din surse limitative, cum ar fi țesuturile de șoarece. Prin urmare, am testat dacă marcarea prin biotinilare mediată de BirA ar funcționa, de asemenea, in vivo la șoarecii transgenici. Deoarece supraexprimarea GATA-1 duce la letalitate embrionară la șoareci (28), am testat această abordare prin marcarea factorului de transcripție eritropoietic esențial EKLF (29). ADNc de șoarece EKLF a fost marcat cu eticheta de biotinilare și un epitop dublu de hemaglutinină și microinjectat în ouă de șoarece pentru a stabili linii de șoareci transgenici. În mod similar, liniile de șoareci transgenici au fost, de asemenea, stabilite prin microinjectarea construcției de casetă de expresie BirA/eritroidă. Liniile de șoareci transgenici cu expresie detectabilă a EKLF marcat și BirA în celulele eritroide au fost selectate și încrucișate. Biotinilarea in vivo a EKLF marcat a fost evaluată în extractele nucleare preparate din ficatul fetal al embrionilor de 13,5 zile postcoitum. Analiza Western blot cu un anticorp anti-EKLF a detectat EKLF endogen, precum și EKLF marcat, care a fost vizualizat ca un dublet (Fig. 4, banda 1). Legarea extractelor nucleare de ficat fetal de bila de streptavidină arată că doar banda superioară din dublet este reținută, ceea ce sugerează că aceasta este biotinilată (Fig. 4, benzile 2 și 3). Această observație este confirmată prin sondarea aceluiași blot cu streptavidină-HRP, care detectează doar o singură bandă (Fig. 4, benzile 7 și 9). Dublul detectat de anticorpul EKLF se datorează, cel mai probabil, utilizării diferențiate a codonilor de inițiere a traducerii la eticheta de biotinilare fuzionată N-terminal (banda de sus) și la epitopul dublu de hemaglutinină prezent imediat în aval, care conține, de asemenea, un codon de inițiere (banda de jos). Ca urmare, numai banda de sus purtând eticheta de biotinilare servește drept substrat pentru BirA, demonstrând astfel și mai mult specificitatea in vivo a acestei abordări. Legarea extractelor nucleare la bilele de streptavidină a arătat, de asemenea, că o proporție semnificativă (≈50%) de EKLF marcat este biotinilat în ficatul fetal al șoarecilor transgenici. Speculăm că diferența de eficiență a biotinilării între celulele transfectate și ficatul fetal (în afară de utilizarea unor proteine de fuziune diferite) poate reflecta o limitare in vivo a disponibilității biotinei (biotina este abundentă în FCS utilizat pentru a suplimenta mediile de cultură celulară) sau o diferență în nivelurile de expresie BirA. Aceste rezultate demonstrează că biotinilarea specifică a EKLF marcat de către BirA bacteriană poate fi obținută, de asemenea, cu o eficiență ridicată in vivo la șoarecii transgenici.

.