Úvod
Existuje přibližně 10 000 pojmenovaných druhů mikrobů. Odhaduje se, že na každý identifikovaný druh připadá dalších 10 000 až 100 000 neidentifikovaných druhů. Existuje nejen mnoho druhů bakterií, ale i mnoho jednotlivých bakterií. V jediné lžíci půdy může být 100 milionů jednotlivých bakterií. Při seškrábání dásní se může objevit 1 milion bakterií na cm2 (cm2 je velký asi jako nehet malíčku). Bakterie v našem těle a na něm tvoří asi 10 % naší suché tělesné hmotnosti.
Většina v současnosti známých druhů bakterií byla identifikována pomocí tradičních mikrobiologických technik, jako je Gramova barvicí reakce, morfologie a metabolické reakce. Bakterie málokdy žijí samostatně, ale ve společenstvích s jinými bakteriemi. To platí jak v životním prostředí, tak v našem těle a na něm. Tato třída se zaměřuje na roli bakterií v nemocech. Izolace jednoho druhu bakterie je prvním krokem k identifikaci bakterie, která je pravděpodobně zodpovědná za chorobný proces.
Prvním požadavkem pro fyzickou izolaci bakterie je, aby ji bylo možné kultivovat v laboratoři. To vyžaduje znalost optimální teploty pro růst, optimálních požadavků na kyslík a optimálních nutričních potřeb. V tomto kurzu pracujeme s velmi omezeným počtem bakterií. Bakterie, se kterými pracujeme, lze také velmi snadno kultivovat v laboratoři. Většina bakterií tak příjemná není!“
Existují dva hlavní způsoby izolace organismů.
- Přerušování izolace na agarové destičce
- Metoda přelévání destiček
Přerušování izolace na agarové destičce zahrnuje postupné ředění organismů, dokud nemáte buňky v dostatečně nízké hustotě, aby byly jednotlivé buňky fyzicky prostorově izolovány a vznikly rozpoznatelné jednotlivé kolonie. Při metodě nalití na destičku se vzorek před přidáním do roztaveného vychlazeného agaru dostatečně naředí a poté se tato směs nalije do misky. Izolované buňky dají vzniknout jednotlivým koloniím rostoucím v samotném agaru. Tato technika může být poněkud složitá. Pokud je roztavený agar příliš horký, zabijete všechny bakterie. Pokud je roztavený agar příliš chladný, vznikne v Petriho misce velká hrouda. Metodou proužkování získáte jednotlivé kolonie na povrchu agaru. Tato technika je mnohem rychlejší a snadněji zvládnutelná.
Přehled
Dostanete vzorek bujónu obsahující tři organismy: Staphylococcus xylosus, Serratia marsescens a Escherichia. coli.
Všechny tři organismy snadno rostou aerobně na tryptickém sójovém agaru (TSA). S. marsescens však tvoří červený pigment pouze při teplotě 35 °C nebo nižší a optimálně při pokojové teplotě (25 °C). Roste velmi rychle při všech teplotách do středně velkých kolonií.
E. coli má hnědý vzhled při všech teplotách a také rychle roste a tvoří velké kolonie.
S. xylosus má žlutooranžový vzhled při všech teplotách, rychle roste a tvoří střední až velké kolonie.
Vaše schopnost izolovat a vidět tyto tři organismy na vaší plotně závisí na vhodných inkubačních podmínkách. Vaše destičky budou inkubovány při pokojové teplotě po dobu 48 hodin. Měli byste být schopni identifikovat tyto tři organismy na základě velikosti kolonií a pigmentu.
Materiály
- 1 směsná kultura ve zkumavce s tryptickým sójovým bujónem (TSB) obsahující Staphylococcus xylosus, Serratia marsescens a Escherichia. Coli (vše BSL2)
- 3 TSA destičky
Postup při prořezávání pro izolaci
Existuje několik metod prořezávání pro izolaci. Naprostá většina našich studentů byla nejúspěšnější s kvadrantovou metodou proužkování, která je popsána níže.
- Označte svou destičku jménem, datem, sekcí a organismem.
- Použijte postupy BSL2 k získání smyčky plné organismů ze zkumavky s tryptickým sójovým bujónem (TSB). Viz protokol o aseptické technice.
- Ujistěte se, že jste zkumavku s bujónem dostatečně promíchali, aby byly organismy v bujónu rovnoměrně suspendovány.
- Znovu uzavřete zkumavku s TSB.
- Další část můžete provádět s destičkou na laboratorním stole nebo ji držet v ruce. Sami se rozhodněte, co vám vyhovuje nejlépe. Lehce přetáhněte smyčku sem a tam po povrchu agaru. (Viz obrázek 1.)
- Čím více táhnete, tím více bakterií ukládáte.
- Obecnou myšlenkou je snížit koncentraci bakterií s každým tahem.
- Zdá se, že čtyři až pět klikatých pohybů funguje dobře.
- Experimentujte s různými destičkami. Nezapomeňte sledovat, co jste na každé destičce udělali.
- Pokud používáte spalovač, sterilizujte smyčku. Pokud používáte plastové smyčky, vyhoďte použitou smyčku do nádoby s kavicidem a pořiďte si novou sterilní plastovou smyčku.
- Nevracejte se zpět do původní zkumavky s bujónem.
- Dotýkejte se smyčkou povrchu agaru proti vzdálenému konci prvního proužku. Opakujte tažením tam a zpět.
- o Netahejte do středu destičky.
- o Na povrchu agaru byste měli být schopni vidět slabé zářezy vaší linie proužkování.
- Pomocí sterilní smyčky opakujte postup u druhého proužku.
- Pomocí sterilní smyčky opakujte postup u třetího proužku. Kličkujte poslední částí do středu destičky.
- Měli byste skončit s izolovanými koloniemi někde v posledním proužku.
- Pokud používáte spalovač, sterilizujte smyčku. Pokud používáte plastové smyčky, vyhoďte použitou smyčku do nádoby na kavicidy.
- Navraťte víčko na destičku.
- Položte hotové destičky agarovou stranou nahoru na inkubační stojan na předním stole v inkubační části.
Obrázek 1. V případě, že používáte plastové smyčky, zlikvidujte je: Kvadrantová metoda proužkování pro izolaci.
Poznámky
- Je naprosto nezbytné, abyste mezi každým proužkováním sterilizovali smyčku, a to buď pomocí inkubátoru, nebo získáním nové sterilní plastové smyčky. To je nejčastější chyba, které se studenti dopouštějí.
- Nenechávejte destičku otevřenou příliš dlouho, jinak se vám do ní dostanou další bakterie z prostředí.
- Nebuďte zklamaní, pokud se vám nepodaří získat izolované kolonie na první pokus. Jedná se o náročný postup.