Přístroj a činidla
Přístrojem pro detekci MTX byl Siemens VIVA-E, který umožňuje přizpůsobení parametrů díky dostupnosti otevřeného kanálu. Reagencie a kalibrátory MTX byly zakoupeny od společnosti Siemens (6L119UL).
Tři úrovně materiálu pro kontrolu kvality (QC) byly zakoupeny od společnosti Bio-Rad (Irvine, Kalifornie), další vlastní materiál QC o koncentraci 0,05 μmol/l od společnosti Aladdin (Šanghaj, Čína).
Srovnání metody MTX bylo provedeno analýzou stejných vzorků pomocí analýzy kapalinovou chromatografií s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) (kapalinová chromatografie LC-20 AD a hmotnostní spektrometr AB SCIEX QTRAP®4500).
Vzorky
Testované vzorky byly získány z hematologického oddělení dětské nemocnice v Dalianu. Některé testované vzorky a vzorky ikterické plazmy bez MTX byly odebrány pro studium interference triglyceridů a bilirubinu. Do léčby pacientů nebylo nijak zasahováno a nebyly uvedeny žádné individuální informace o pacientech.
Příprava reagencií
Sada reagencií Siemens obsahuje protilátkové/substrátové reagencie A, enzymové reagencie B, pufrový koncentrát pro analýzu léčiv Emit a kalibrátory Emit Methotrexate. Reagencie A a B byly rekonstituovány s 3,0 ml deionizované vody, promíchány jemným vířením a ekvilibrovány při pokojové teplotě po dobu 1 h. Koncentrát MTX pufru byl smíchán s deionizovanou vodou (1:15 v/v). Pracovní roztok činidla A a B byl připraven zředěním zásobních roztoků pufrovým roztokem v poměru 1:9 v/v.
Některé kalibrátory (0, 0,20, 0,50, 1,00 μmol/l) byly rekonstituovány na uvedenou koncentraci s 1. roztokem pufru.0 ml deionizované vody podle pokynů výrobce, jiné kalibrátory 1,50 a 2,00 μmol/l byly rekonstituovány na 1,00 μmol/l s 1,50 a 2,00 ml deionizované vody. Poté byl kalibrátor 0,20 μmol/l zředěn na 0,05 μmol/l a kalibrátor 1,00 μmol/l byl zředěn na 0,10 a 0,25 μmol/l. Nová sada kalibrátorů (0, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50 a 1,00 μmol/L) splňuje požadavky modifikované kalibrační křivky.
Programování přístroje Viva-E
Otevřený kanál na přístroji Viva-E byl naprogramován tak, aby se změnily objemy činidel A & B ze 180 μl na 110 μl (110 μl je spodní limit přístroje Viva-E pro činidla MTX). Šestibodová kalibrační křivka byla naprogramována pomocí modifikované kubické spline regrese. Šest kalibrátorů dodaných soupravou bylo 0, 0,20, 0,50, 1,00, 1,50 a 2,00 μmol/l. Když byly objemy činidel A a B sníženy, nestačily reagovat se vzorky většími než 1 μmol/l. V důsledku toho byla nová kalibrační sada modifikované zkoušky EMIT změněna na 0, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 μmol/L v rozsahu 0,05 až 1,00 μmol/L.
Podle pokynů komerční soupravy by se vzorky o koncentraci vyšší než 1,00 μmol/L měly ředit do rozsahu kalibrační křivky (0,05 μmol/L).05-1,00 μmol/L) pomocí ředicího faktoru 10, 100 nebo 1000.
Mezní hodnota slepého pokusu, mez detekce, mez kvantifikace
Mezní hodnota slepého pokusu (LOB), mez detekce (LOD), mez kvantifikace (LOQ) byly stanoveny podle CLSI EP17-A . LOB byla stanovena pomocí šesti vzorků (S1-S6, 10 opakování po dobu 10 dnů): S1 a S2 byly nulové kalibrátory ze dvou různých kalibračních šarží, S3 a S4 byly ředidla, S5 a S6 byly slepé vzorky plazmy. LOD byla stanovena s 5 skupinami vzorků s nízkou koncentrací v rozmezí od LOB do čtyřnásobku LOB (12 opakování během 12 dnů). LOB a LOD byly stanoveny pomocí dvou šarží činidel. Podle klinických požadavků byla cílová hodnota celkové chyby stanovena na 20 %. Výsledky testů studie LOD byly použity k odhadu chyby a nepřesnosti pro každou úroveň analytu. Poté byly tyto údaje zkombinovány pro odhad celkové chyby na každé úrovni a stanovení meze stanovitelnosti (LOQ).
Intradenní a interdenní nepřesnost
Intradenní (n = 10) nepřesnost modifikovaného testu byla vyhodnocena pomocí jedné úrovně kontrolních materiálů (0,05 μmol/l) a tří úrovní vzorků pacientů (0,12, 0,43, 0,82 μmol/l). Na každé úrovni bylo provedeno 10 opakování. Mezidenní (n = 25) nepřesnost byla testována na těchto 4 úrovních v 5 po sobě jdoucích dnech a 5 opakováních pro každou úroveň. Všechny vzorky byly získány od různých pacientů. Naměřené výsledky byly vyneseny do grafu proti očekávaným hodnotám.
Linearita
Linearita byla ověřena ředěním kontroly kvality 2,00 μmol/l (hc) pufrem (c0) v následujících poměrech: 1hc + 1c0 (1,00 μmol/l), 2hc + 3c0 (0,80 μmol/l), 1hc + 2co (0,67 μmol/l), 1hc + 3co (0.50 μmol/l), 1hc + 5co (0,33 μmol/l), 1hc + 9co (0,20 μmol/l), 1hc + 19co (0,10 μmol/l), 1hc + 39co (0,05 μmol/l). Každé ředění bylo analyzováno třikrát, rovnice linearity modifikované zkoušky byla vypočtena na základě průměrů naměřených výsledků a očekávaných hodnot.
Postup zkoušky LC-MS/MS
Zkouška LC-MS/MS provedená v této studii je následující. Jako vnitřní standard byl použit difenhydramin. Jako srážedlo séra k odstranění albuminu byl použit acetonitril. Pro LC separaci byla použita kolona Hypersil ODS-BP C18 (5 μm, 2,1 × 150 mm). Mobilní fází byla 0,1% kyselina mravenčí a acetonitril. Gradientová eluce probíhala při průtoku 0,5 ml/min při 30 °C. K detekci MTX a difenhydraminu byl použit režim vícenásobného monitorování reakcí (MRM) ve zdroji ionizace elektrosprejem (ESI) a režim skenování pozitivních iontů. MTX byl detekován při m/z 455,0 → 308,1, difenhydramin byl detekován při m/z 256,0 → 167,0 .
Srovnání metod
Sedmdesát devět vzorků bylo odebráno od pacientů s akutní lymfoblastickou leukemií na hematologickém oddělení dětské nemocnice v Dalianu. Každý vzorek byl testován pomocí modifikovaného testu EMIT, respektive LC-MS/MS. Výsledky byly porovnány pomocí jednoduché lineární regresní analýzy (MedCalc Statistical Software verze 15.6.1). Dalších 45 vzorků bylo testováno pomocí modifikovaného testu EMIT a komerčního testu EMIT pro porovnání metody .
Studie interference
Interference triglyceridů byla hodnocena přípravou vzorků s Intralipidem (20% emulze IV tuku). Koncentrace triglyceridů ve vzorcích byla 1000 ng/dl. Poté byl proveden test Paired-T.
Interference bilirubinu byla simulována pomocí některých vzorků ikterické plazmy bez MTX s koncentrací bilirubinu ne nižší než 30 mg/dl.
Interference strukturně příbuzného metabolitu 7-hydroxy-methotrexátu byla hodnocena přidáním různých hladin 7-hydroxy-methotrexátu do vzorků plazmy, koncentrace MTX v těchto vzorcích byla 0,05 μmoL/L. A výsledky testů současných vzorků byly porovnány s výsledky původních vzorků .