Celkovým cílem tohoto testu inhibice hemaglutinace je změřit titry protilátek proti specifickým zájmovým virům. Tato metoda může pomoci zodpovědět klíčové otázky v oblasti vakcinologie týkající se imunity a ochrany zprostředkované vakcínou v rámci různých populací a napříč různými věkovými skupinami a skupinami pacientů. Hlavní výhody této techniky spočívají v tom, že je přesná a že umožňuje rychlé stanovení titru přítomnosti neutralizačních protilátek.
Ačkoli tato metoda může poskytnout přehled o titrech lidských protilátek, lze ji použít i na jiné systémy, například titry protilátek pro myší sérum, také supernatanty kultur. Začněte označením 96jamkových mikrotitračních destiček příslušnými experimentálními informacemi. Poté otočte destičku do vertikální orientace a pomocí vícekanálové pipety přidejte 25 mikrolitrů PBS do každé jamky, kromě první jamky spodní zadní titrační řady.
Přidejte 50 mikrolitrů čerstvě připraveného roztoku antigenu, který vás zajímá, do první jamky zadní titrační řady a poté přidejte 25 mikrolitrů vzorků séra ošetřeného RDE do prvních jamek horních deseti řad. Přidejte 25 mikrolitrů příslušného antiséra do první jamky jedenácté řady jako pozitivní kontrolu. Přeneste 25 mikrolitrů z první jamky každé řady do jejich následujících jamek, abyste provedli sériové, dvojnásobné ředění.
Pipetujte 10 až 15krát nahoru a dolů pro každý krok ředění a vyhoďte posledních 25 mikrolitrů z posledních jamek. Poté přidejte 25 mikrolitrů roztoku antigenu do každé jamky v řadách 1 až 11 a 25 mikrolitrů PBS pouze do každé jamky v zadní titrační řadě. Deskou 10krát opatrně poklepejte na všechny čtyři strany, aby se promíchala.
Poté desku zakryjte na 30 minut při pokojové teplotě. Na konci inkubace přidejte do každé jamky 50 mikrolitrů roztoku červených krvinek a desku dalším poklepáním promíchejte. Poté destičku opět zakryjte a inkubujte červené krvinky podle použitého druhu, jak je uvedeno v tabulce.
Po přidání červených krvinek do destičky dodržte příslušnou dobu inkubace pro druh krve použitý v testu. Příliš krátká nebo příliš dlouhá inkubace povede k nesprávné interpretaci výsledků. Na konci inkubace vyhodnoťte hemaglutinaci nakloněním destičky o 90 stupňů na 25 sekund a vyznačte výsledky pro každou jamku, když je destička stále nakloněná, na vytištěném schématu 96jamkové destičky.
V tomto experimentu byla hodnocena protilátková odpověď vyvolaná vakcínou u 26 zdravých dobrovolníků, kteří před chřipkovou sezónou 24 2015 obdrželi inaktivovanou trivalentní chřipkovou vakcínu obsahující chřipku A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 a B/Massachusetts/O2/2012. Byla pozorována zkřížená imunitní odpověď na kmeny virů A/H3N2/Švýcarsko/2013 a A/H3N2/Texas/2012 s významně nižšími geometrickými průměrnými titry inhibice hemaglutinace a indukovanou séroprotekcí proti chřipce A/H3N2/Švýcarsko/2013 ve srovnání s chřipkou A/H3N2/Texas/2012. Po očkování se titry protilátek proti oběma kmenům zvýšily, i když kmen A/H3N2/Switzerland/2013 nebyl ve vakcíně přítomen.
Virální hemaglutinin vykazuje druhově závislý potenciál pro hemaglutinaci erytrocytů. Zajímavé je, že krev morčat správně nehemaglutinuje s chřipkou B a krev krůt má potenciál pro hemaglutinaci s vysokými titry a nízkou zkříženou reaktivitou. Po zvládnutí této techniky ji lze dokončit do tří hodin, pokud je provedena správně.
Při pokusu o tento postup je důležité pamatovat na sérum s RDE, aby se inaktivovaly všechny nespecifické inhibitory a nespecifické vazby během hemaglutinace viru. Po tomto postupu lze provést další metody, jako je ELISA, aby se zodpověděly další otázky týkající se úlohy jednotlivých imunoglobulinů specifických pro patogen. Po svém vývoji tato technika vydláždila výzkumníkům v oblasti virové imunologie cestu k dalšímu pochopení imunity související s očkováním u zdravých a imunosuprimovaných pacientů v rámci různých věkových skupin.
Po zhlédnutí tohoto videa byste měli dobře rozumět tomu, jak provádět hemaglutinační inhibiční test ke kvantifikaci titrů specifických protilátek proti chřipkovému kmeni ve velkém měřítku. Nezapomeňte, že práce s virovými antigeny, zvířecí krví a vzorky lidského séra může být velmi nebezpečná a že při provádění tohoto postupu je třeba vždy dodržovat bezpečnostní opatření, jako je práce v laboratoři BSL2.
.