RNáza A: často kladené otázky | AG Scientific Blog

Úvod k RNáze

Ribonukleázy (RNázy) jsou velkou skupinou hydrolytických enzymů, které rozkládají molekuly ribonukleové kyseliny (RNA). Jedná se o nukleázy, které katalyzují rozklad RNA na menší složky. Jsou nadrodinou enzymů, které katalyzují rozklad RNA a působí na úrovni transkripce a translace.

3D konformace enzymu ribonukleázy A

Tyto enzymy jsou přítomny ve všech živých buňkách a biologických tekutinách, včetně prokaryot a eukaryot, a plní mnoho důležitých funkcí. RNázy jsou všudypřítomné a v nechráněném prostředí mají velmi krátkou životnost. Mezi jejich cytotoxické účinky patří štěpení RNA vedoucí k inhibici syntézy proteinů a indukci apoptózy. Tyto cytotoxické účinky lze vyvolat aplikací RNázy na vnější povrch buňky, ale bylo zjištěno, že cytotoxicita se 1000krát zvýší, když je enzym uměle zaveden do cytosolu, což ukazuje na internalizaci do buňky jako na rychlost limitující krok toxicity.

RNázy se dělí na endoribonukleázy a exoribonukleázy. Endoribonukleasy jsou formy A, P, H, I, III, T1, T2, U2, V1, PhyM a V.

Exoribonukleasy zahrnují RNasy formy PH, II, R, D a T, jakož i polynukleotidfosforylázu (PNPase), oligoribonukleasu, exoribonukleasu I a exoribonukleasu II. Tyto enzymy štěpí různé druhy RNA odlišně.

V poslední době věnují vědci pozornost RNázám jako možným látkám pro léčbu rakoviny. Jde o to najít enzym, který by selektivně poškozoval rakovinné buňky, aniž by ovlivnil okolní normální buňky.

Produkty RNázy A od společnosti AG Scientific, Inc.

Často kladené otázky o RNáze A

Co je RNáza A?

Ribonukleáza A je trávicí enzym vylučovaný slinivkou břišní, který specificky „tráví“ nebo hydrolyzuje polymery RNA (nikoli však DNA) endonukleázovým štěpením fosfodiesterových vazeb tvořících kovalentní vazby mezi sousedními ribonukleotidovými zbytky v těchto molekulách.

Co znamená „A“ ve slově RNáza A?

„A“ v jejím názvu neodkazuje na její substrátovou specifitu, ale na převažující formu enzymu produkovanou hovězí slinivkou břišní. RNáza A je nemodifikovaná, zatímco RNáza B, RNáza C a RNáza D jsou směsi glykoforem.

Pro svou dostupnost ve velkém množství a vysokou čistotu byla RNáza A předmětem přelomových prací v proteinové chemii a enzymologii. Kromě toho cytotoxické varianty a homology tohoto enzymu prokázaly užitečnost jako chemoterapeutika.

Jaká je historie tohoto enzymu?

Použil ji Christian Anfinsen, aby dokázal, že sekvence aminokyselin, určuje strukturu složeného proteinu, a použili ji Stanford Moore a William Stein, aby ukázali, že v katalytickém centru enzymů se používá specifické uspořádání aminokyselin.

Ribonukleáza A byla také prvním enzymem syntetizovaným R. Brucem Merrifieldem, který ukázal, že biologické molekuly jsou jednoduše chemické entity, které lze uměle zkonstruovat. Všechny tyto ústřední koncepty, objevené s pomocí ribonukleázy, byly oceněny Nobelovou cenou.

Jaká je struktura RNázy A?

Struktura RNasy

Relativně malá, 124 aminokyselinová sekvence RNasy A, která má molekulovou hmotnost 12 600 Da. obsahuje čtyři His zbytky, přičemž dva ze zbytků His12 a His119 jsou přímo zapojeny jako katalytické zbytky tohoto enzymu. Imidazolový kruh His12 má anonymně nízkou hodnotu pK (pK < 6,0), což naznačuje, že pro katalýzu musí být deprotonován. Naopak imidazolový kruh His119 má anonymně vysokou hodnotu pK (pK > 6,0), což naznačuje, že musí být pro katalýzu protonován.

Je ribonukleáza A protein?

RNáza A je malý protein, zralý enzym má pouze 124 aminokyselinových zbytků bez připojeného sacharidu. Na rozdíl od jiných enzymů obsahuje RNasa A 19 z 20 kyselin, chybí pouze tryptofan.

Jaký je mechanismus účinku?

His12 působí jako obecná báze, akceptuje 2′-OH proton z přisedlého kruhu ribonukleového cukru. To podporuje nukleofilní útok 2′-O na kladněji nabitý atom fosforu (P), čímž vzniká meziprodukt 2′-,3′-cyklického ribonukleotidu fosfát. Vznik tohoto meziproduktu usnadňuje imidazol His119, který působí jako obecná kyselina a daruje svůj proton atomu kyslíku v náchylné vazbě P-O-R‘.

Pro druhý krok reakce jsou obecné kyselé a zásadité aktivity postranních řetězců těchto dvou His zbytků obráceny. His12 působí jako obecná kyselina, která daruje svůj nově získaný proton 2′-,3′-cyklickému meziproduktu ribonukleotidfosfátu, zatímco His119, který působí jako obecná báze, přijímá proton z vody, aby podpořil hydroxylový útok na stejný 2′-,3′-cyklický meziprodukt.

Jaké je štěpné místo RNasy A?

RNasa A účinně hydrolyzuje kontaminanty RNA v preparátech DNA tím, že štěpí fosfodiesterovou vazbu mezi 3′-fosfátovou skupinou pyrimidinového nukleotidu (C a U) a 5′-ribozou jeho sousedního nukleotidu 1, 2, 3. RNasa A je schopna štěpit nukleotidový meziprodukt. Vzniklý meziprodukt 2′-,3′-cyklický fosfodiester je pak dále hydrolyzován na 3′-monofosfátovou skupinu. Bovinní pankreatická RNáza A je velmi stabilní protein o 124 aminokyselinách s nejvyšší naměřenou aktivitou vůči jednořetězcové RNA a dvojnásobně rychlejším štěpením na cytidinových zbytcích ve srovnání s uridylovými zbytky.

Jaká je acidobazická katalytická reakce RNázy A?

RNáza A také využívá acidobazickou katalýzu k chemické změně svých substrátů. Kyselé nebo zásadité zbytky enzymu přenášejí protony na reaktant nebo z něj, aby stabilizovaly vyvíjející se náboje v přechodném stavu. Přenos protonů obvykle vytváří lepší odstupující skupiny, čímž se reakce stává energeticky příznivější.

Histidin je velmi častým aminokyselinovým zbytkem zapojeným do katalýzy, protože histidin má hodnotu pKa blízkou neutrální, (pKa=6); histidin proto může při fyziologickém pH přijímat i odevzdávat protony.

Jaká je stabilita ribonukleázy A?

Ribonukleáza A je úžasně stabilní. Například při jednom postupu čištění ribonukleázy A z kravské slinivky se extrakty ošetří kyselinou sírovou a pak se zahřejí téměř k varu a ribonukleáza A je jediná, která přežije. To není překvapivé, protože je vylučována slinivkou břišní a musí vykonávat svou práci v nehostinném prostředí trávicího traktu. Stabilita ribonukleázy A je z velké části způsobena čtyřmi disulfidovými vazbami, které slepují různé části řetězce dohromady.

Všeobecně platí, že v zájmu zachování stability skladujte výrobek a manipulujte s ním podle pokynů prodejce.

Jak se RNáza A inaktivuje?

RNáza A je poměrně stabilní enzym a obsahuje 4 disulfidové můstky, které se vyskytují u všech pankreatických ribonukleáz savců. Když jsou můstky reduktivně porušeny, protein je denaturován a stává se neaktivním. Při reoxidaci se protein znovu sbalí a obnoví se jeho úplná aktivita. Je však možné redukovat můstky pouze částečně a zachovat aktivitu enzymu. Odstraněním 4 peptidů na karboxylovém konci se aktivita enzymu zničí.

Co inhibuje RNasu A?

Uridinvanadát je silný kompetitivní inhibitor RNasy A. Jeho účinnost spočívá v tom, že jeho struktura napodobuje přechodný stav, který je mezistupněm v reakci.

Jak se připravuje RNáza A ze zásoby?

RNáza A se obvykle připravuje vařením zásoby po dobu 10 minut, aby se odstranila kontaminující aktivita DNázy bez ovlivnění RNázy. Zahřátí na 65 °C RNasu neovlivní.

Jak rekonstituovat připravenou zásobu RNasy A?

RNasa A může být rozpuštěna v koncentraci 1 až 10 mg/ml v 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 15 mM NaCl, zahřát na 100 °C po dobu 15 minut k inaktivaci kontaminujících DNáz a pomalu ochladit na pokojovou teplotu a dávkovat do alikvotů.

Jaká je pracovní koncentrace tohoto enzymu?

Doporučená pracovní koncentrace RNázy A je 1 až 100 µg/ml v závislosti na aplikaci. Enzym je aktivní v širokém rozsahu reakčních podmínek. Při nízkých koncentracích solí (0 až 100 mM NaCl) štěpí RNáza A jednovláknovou i dvouvláknovou RNA a také vlákna RNA v hybridech RNA-DNA.

Jaká je teplota skladování a manipulační opatření pro tento produkt?

Skladujte v těsně uzavřené lahvičce při teplotě -20ºC. Po otevření jej dehydratujte nad silikagelem ve vakuu a poté jej vraťte do -20ºC. Při manipulaci dbejte zvýšené opatrnosti. Nepoužívejte tuto látku, pokud nejste plně proškoleni nebo si nejste vědomi souvisejících rizik.

Jaké jsou aplikace RNázy A?

RNázy hrají důležitou roli při degradaci a obratu RNA ve všech organismech. Enzym ribonukleáza může rozbalovat šroubovici RNA tím, že se komplexuje s jednořetězcovou RNA.

RNáza A je endoribonukleáza s funkcí v metabolismu RNA a regulaci genové exprese.

Bylo zjištěno, že RNáza A hraje důležitou roli u onemocnění, jako jsou autoimunitní choroby, renální insuficience a poruchy slinivky břišní. Nedávno byla také zaznamenána protinádorová aktivita RNázy A s cytotoxickými a cytostatickými vlastnostmi. Členové nadrodiny RNáz A jsou široce exprimováni a přítomni v séru a tkáních savců.

Enzym lze použít k hydrolyzaci RNA z proteinových vzorků. Je kompatibilní pro použití v testech ochrany proti RNáze, k odstranění nespecificky vázané RNA, při analýze sekvencí RNA, k hydrolyzaci RNA obsažené v proteinových vzorcích a při purifikaci DNA.

Jaký je vzhled/forma tohoto produktu?

Dodává se jako bílý chromatograficky přečištěný, bez soli, lyofilizovaný prášek. Vzhled/forma výrobku se může lišit v závislosti na výrobci.

Další čtení

• Zdroje kontaminace DNA v laboratoři
• Guanidin-thiokyanát v lyzačních pufrech RNA
• 8 Výhody volby AGS jako dodavatele proteinázy K

.