Abstract
Glykogenfosforyláza je důležitý enzym pro metabolismus sacharidů ve svalech. Využívá anorganický fosfát k odstranění glukózy z glykogenu, čímž vzniká glukóza-1-fosfát, který může být využit k výrobě ATP. Neaktivní glykogenfosforyláza (fosforyláza h) je aktivována buď alosterickou vazbou 5′-AMP, nebo fosforylací fosforylázovou kinázou (PhK). Fosforylací vzniká fosforyláza a, která je aktivní v nepřítomnosti AMP. PhK je jediná kináza, která může fosforylovat fosforylázu b, která je zase jediným substrátem pro PhK. Tento disertační výzkum se pokusil zjistit důvody této specifičnosti a způsob, jakým se tyto dva enzymy vzájemně rozpoznávají, a to studiem mutantů glykogenfosforylázy řízených místem; u všech mutantů byly zjišťovány změny v jejich interakci se zkrácenou formou katalytické podjednotky fosforylázové kinázy, gama(1–300). Tři mutace (R69K, R69E a E501A) provedené v místech, která interagují s aminoterminálem fosforylázy b nebo a, vykazovaly malý rozdíl ve fosforylaci gama(1–300) ve srovnání s fosforylázou b. Pět mutací provedených na třech místech v amino-terminálním chvostu fosforylázy (K11A, K11E, I13G, R16A a R16E) však způsobilo snížení katalytické účinnosti pro gama(1–300) ve srovnání s fosforylázou b. R16E byla nejhorším substrátem pro gama(1–300) a způsobila 47násobné snížení katalytické účinnosti. Amino-terminus, a zejména Arg 16, jsou velmi důležitými faktory pro rozpoznání fosforylázy gama(1–300). Kromě toho byly I13G a R16A schopny fosforylace proteinkinázou A, která nativní fosforylázu nerozpoznává;U některých mutantů byly také pozorovány změněné konformační stavy. R16A a R16E se aktivovaly při velmi nízké koncentraci AMP a krystalizovaly při nízké teplotě jako fosforyláza a. To naznačuje, že i bez fosforylace se jejich struktury podobají spíše fosforyláze a než fosforyláze b. Dva další mutanty vyvolaly opačný efekt a po fosforylaci se chovaly jako fosforyláza b. V případě R16A a R16E se jednalo o mutanty, které se po fosforylaci chovaly jako fosforyláza b. V případě R16A a R16E se jednalo o mutanty, které se po fosforylaci chovaly jako fosforyláza a. R69E byla fosforylací aktivována pouze částečně a I13G byla po fosforylaci zcela neaktivní. I13G byla prvním pozorováním formy fosforylázy, která nemohla být aktivována fosforylací
.