Verhoeff-Van Giesonův (VVG) barvicí protokol pro elastická vlákna
NovaUltra Special Stain Kits
Popis: Tato metoda se používá k identifikaci elastických vláken ve tkáních, jako je kůže, aorta atd., na řezech fixovaných formalínem a zalitých parafínem a lze ji použít i pro zmrazené řezy. Elastická vlákna se zbarví modročerně a pozadí se zbarví žlutě.
Fixace: 10% formalín.
Řez: parafinové řezy o velikosti 5 um.
Roztoky a činidla:
5% alkoholový hematoxylin:
Hematoxylin ———————————- 5 g
100% alkohol ———————————- 100 ml
Smíchejte do rozpuštění za pomoci mírného tepla. Filtrovat.
10% vodný chlorid železitý (připravit čerstvý, není nutné):
Chlorid železitý ——————————– 10 g
Destilovaná voda ——————————– 100 ml
Roztok Weigertova jódu:
Jodid draselný —————————— 2 g
Jód ——————————————- 1 g
Destilovaná voda ——————————— 100 ml
K rozpuštění jodidu draselného použijte 4 ml destilované vody. A poté přidejte jód. Jakmile je jód rozpuštěn, zřeďte tento roztok přidáním 96 ml destilované vody. Tento roztok lze připravit čerstvý podle potřeby nebo jej připravit ve větším množství a uchovávat v hnědé láhvi ve tmě při pokojové teplotě.
Verhoeffův pracovní roztok:
Pracovní barvicí roztok by měl být pro dosažení nejlepších výsledků připraven čerstvý. Nebude uspokojivě barvit, pokud bude uchováván déle než jeden pracovní den. Pracovní roztok připravte přidáním následujících činidel v uvedeném pořadí:
5% alkoholový hematoxylin ——————– 20 ml
10% chlorid železitý —————————- 8 ml
Weigertův roztok jódu ——————- 8 ml
Výše uvedená množství (nebo jejich potřebné poměry) dobře promíchejte. Roztok by měl být černý. Použijte okamžitě a po použití zlikvidujte.
2% vodný roztok chloridu železitého (připravte si čerstvý, není nutné):
10% chlorid železitý z výše uvedeného ———— 10 ml
Destilovaná voda ——————————- 50 ml
5% vodný roztok thiosíranu sodného:
Van Giesonova protibarva:
1% vodná kyselina fuchsinová ——————— 5 ml
nasycená vodná kyselina pikrová ————– 100 ml
Pro nervové tkáně lze připravit následujícím způsobem:
1% vodná kyselina fuchsinová ——————- 15 ml
nasycená vodná kyselina pikrová ————- 50 ml
destilovaná voda ——————————- 50 ml
Postup:
1. Deparafinujte a hydratujte sklíčka do destilované vody.
2. Obarvujte ve Verhoeffově roztoku po dobu 1 hodiny. Tkáň by měla být zcela černá.
3. Opláchněte ve vodovodní vodě s 2-3 výměnami.
4. Diferencujte ve 2% chloridu železitém po dobu 1-2 minut.
5. Přerušte diferenciaci několika výměnami vodovodní vody a mikroskopicky zkontrolujte, zda jsou černě zbarvená elastická vlákna a šedé pozadí. Je lepší tkáň mírně poddiferencovat, protože následné Van Giesonovo protibarvení může elastické barvivo poněkud extrahovat.
6. Omyjte sklíčka ve vodovodní vodě.
7. Ošetřete 5% thiosíranem sodným po dobu 1 minuty. Roztok zlikvidujte.
8. Promývejte 5 minut v tekoucí vodovodní vodě.
9. Kontrabarvení ve Van Giesonově roztoku po dobu 3-5 minut.
10. Rychlá dehydratace 95% alkoholem, 2 výměny 100% alkoholu
11. Vyčistěte ve 2 výměnách xylenu po dobu 3 minut
12. Přikryjte pryskyřičným montážním médiem.