Det overordnede mål med dette hæmagglutinationshæmningsassay er at måle antistoftiterne mod specifikke virus af interesse. Denne metode kan bidrage til at besvare centrale spørgsmål inden for vaccinologi om den vaccineformidlede immunitet og beskyttelse inden for forskellige befolkningsgrupper og på tværs af forskellige alders- og patientgrupper. De vigtigste fordele ved denne teknik er, at den er nøjagtig, og at den giver mulighed for hurtig titerbestemmelse af tilstedeværelsen af neutraliserende antistoffer.
Selv om denne metode kan give indsigt i humane antistoftitere, kan den også anvendes på andre systemer, f.eks. antistoftitere for museserum, samt kulturovernatanter. Begynd med at mærke 96 brønde mikrotiterplader med de relevante eksperimentelle oplysninger. Derefter vendes pladen i lodret retning, og der tilsættes 25 mikroliter PBS med en multikanalspipette til hver brønd, undtagen den første brønd i den nederste bagtitreringsrække.
Der tilsættes 50 mikroliter af den nytilberedte antigenopløsning af interesse til den første brønd i bagtitreringsrækken, efterfulgt af tilsætning af 25 mikroliter RDE-behandlede serumprøver til de første brønde i de ti øverste rækker. Der tilsættes 25 mikroliter af det relevante antiserum til den første brønd i den 11. række som en positiv kontrol. Der overføres 25 mikroliter fra den første brønd i hver række til de efterfølgende brønde for at foretage serielle, to-dobbelte fortyndinger.
Pipetter op og ned 10 til 15 gange for hvert fortyndingstrin, idet de sidste 25 mikroliter fra de sidste brønde kasseres. Derefter tilsættes 25 mikroliter af antigenopløsningen til hver brønd i række 1 til 11 og 25 mikroliter PBS alene til hver brønd i den bageste titreringsrække. Der bankes forsigtigt på pladen 10 gange på alle fire sider for at blande den.
Dæk derefter pladen til i 30 minutter ved stuetemperatur. Ved inkubationens afslutning tilsættes 50 mikroliter opløsning af røde blodlegemer til hver brønd, og pladen blandes ved at banke mere på den. Dæk derefter pladen igen, og inkubér de røde blodlegemer i overensstemmelse med den anvendte art som angivet i tabellen.
Når de røde blodlegemer tilsættes til pladen, overholdes den passende inkubationstid for den blodtype, der er anvendt i assayet. En for kort eller for lang inkubationstid vil føre til en forkert fortolkning af resultaterne. Ved inkubationens afslutning vurderes hæmagglutinationen ved at vippe pladen 90 grader i 25 sekunder og markere resultaterne for hver brønd, mens pladen stadig er vippet, på et trykt skema af 96-brøndpladen.
I dette forsøg blev det vaccineinducerede antistofrespons vurderet hos 26 raske frivillige, der modtog en inaktiveret, trivalent influenzavaccine indeholdende influenza A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 og B/Massachusetts/O2/2012 forud for influenzasæsonen 24 2015. Der blev observeret et krydsreaktivt immunrespons for A/H3N2/Schweiz/2013 og A/H3N2/Texas/2012-virusstammer med signifikant lavere geometrisk middelværdi af hæmagglutinationshæmningstiterne og induceret seroprotektion mod influenza A/H3N2/Schweiz/2013 sammenlignet med influenza A/H3N2/Texas/2012. Efter vaccination steg antistoftiterne mod begge stammer, selv om A/H3N2/Schweiz/2013-stammen ikke var til stede i vaccinen.
Viralt hæmagglutininin udviser et artsafhængigt potentiale for erythrocythæmagglutination. Det er interessant, at marsvineblod ikke hæmagglutinerer korrekt med influenza B, mens kalkunblod har potentiale for hæmagglutination med høje titre og en lav krydsreaktivitet. Når først denne teknik er behersket, kan den gennemføres på tre timer, hvis den udføres korrekt.
Ved forsøg på denne procedure er det vigtigt at huske at serumere med RDE for at inaktivere eventuelle uspecifikke inhibitorer og uspecifik binding under hæmagglutinationen af viruset. Efter denne procedure kan der udføres andre metoder som ELISA for at besvare yderligere spørgsmål om den rolle, som de enkelte patogenspecifikke immunoglobuliner spiller. Efter udviklingen banede denne teknik vejen for forskere inden for viral immunologi til at fremme vores forståelse af vaccinerelateret immunitet hos raske og immunsupprimerede patienter inden for forskellige aldersgrupper.
Når du har set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan man udfører et hæmagglutinationsinhiberingsforsøg for at kvantificere influenzastammens specifikke antistoftitere i stor målestok. Glem ikke, at det kan være yderst farligt at arbejde med virale antigener, dyreblod og humane serumprøver, og at der altid skal træffes forholdsregler som f.eks. at arbejde i et BSL2-laboratorium, mens du udfører denne procedure.