Instrument og reagenser
Instrumentet til MTX-detektion var Siemens VIVA-E, som giver mulighed for parametertilpasning ved at have en åben kanal. MTX-reagenser og kalibratorer blev købt hos Siemens (6L119UL).
Tre niveauer af kvalitetskontrolmateriale (QC) blev købt hos Bio-Rad (Irvine, CA), et yderligere brugerdefineret QC-materiale på 0,05 μmol/L fra Aladdin (Shanghai, Kina).
MTX-metodesammenligning blev udført ved at analysere de samme prøver ved hjælp af væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) assay (LC-20 AD væskekromatografi og AB SCIEX QTRAP®4500 massespektrometre).
Prøver
Testprøverne blev indhentet fra den hæmatologiske afdeling på Dalians børnehospital. Nogle testprøver og MTX-fri ikteriske plasmaprøver blev indsamlet til undersøgelse af triglycerid- og bilirubininterferens. Der blev ikke grebet ind i behandlingen af patienterne, og ingen af patienternes individuelle oplysninger blev nævnt.
Reagensfremstilling
Siemens Reagenssæt indeholder Antistof/Substrat Reagens A, Enzym Reagens B, Emit Drug Assay Buffer Concentrate og Emit Methotrexate Calibrators. Reagens A og B blev rekonstitueret med 3,0 mL deioniseret vand, blandet ved let omrøring og ækvilibreret ved stuetemperatur i 1 time. MTX-bufferkoncentrat blev blandet med deioniseret vand (1:15 v/v). Arbejdsopløsning af reagens A og B blev fremstillet ved at fortynde stamopløsninger 1:9 v/v med bufferopløsning.
En del kalibratorer (0, 0,20, 0,50, 1,00 μmol/L) blev rekonstitueret til den angivne koncentration med 1.0 mL deioniseret vand i henhold til producentens anvisninger, andre kalibratorer 1,50 og 2,00 μmol/L blev rekonstitueret til 1,00 μmol/L med henholdsvis 1,50 og 2,00 mL deioniseret vand. Derefter blev 0,20 μmol/L-kalibratoren fortyndet til 0,05 μmol/L, og 1,00 μmol/L-kalibratoren blev fortyndet til 0,10 og 0,25 μmol/L. Det nye sæt kalibratorer (0, 0,05, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50 og 1,00 μmol/L) opfylder kravene til den modificerede kalibratorkurve.
Programmering af Viva-E-instrumentet
En åben kanal på Viva-E blev programmeret til at ændre volumenet af reagens A & B fra 180 μL til 110 μL (110 μL er Viva-E’s nedre grænse for MTX-reagenser). En seks-punkts kalibreringskurve blev programmeret med modificeret cubisk spline-regression. De seks kalibratorer, der leveres af sættet, var 0, 0,20, 0,50, 1,00, 1,50 og 2,00 μmol/L. Når mængderne af reagens A og B blev reduceret, var de ikke tilstrækkelige til at reagere med prøver på mere end 1 μmol/L. Som følge heraf blev det nye kalibratorsæt for det modificerede EMIT-assay ændret til 0, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 μmol/L inden for et interval på 0,05 til 1,00 μmol/L.
I henhold til instruktionen for det kommercielle kit skal prøverne med en koncentration på mere end 1,00 μmol/L fortyndes til kalibreringskurvens omfang (0.05-1,00 μmol/L) ved hjælp af en fortyndingsfaktor på 10, 100 eller 1000.
Blankegrænse, detektionsgrænse og kvantificeringsgrænse
Blankegrænse (LOB), detektionsgrænse (LOD) og kvantificeringsgrænse (LOQ) blev bestemt i henhold til CLSI EP17-A . LOB blev analyseret ved hjælp af seks prøver (S1-S6, 10 gentagelser over 10 dage): S1 og S2 var nulkalibratorer fra to forskellige kalibratorpartier, S3 og S4 var fortyndingsmiddel, S5 og S6 var blindplasma. LOD blev analyseret med 5 lavniveauprøvepuljer, der varierede fra LOB til fire gange LOB (12 replikater over 12 dage). LOB og LOD blev bestemt ved hjælp af to reagenspartier. I overensstemmelse med de kliniske krav blev målet for den samlede fejl sat til 20 %. Testresultaterne af LOD-undersøgelsen blev anvendt til at estimere bias og upræcision for hvert niveau af analysanden. Derefter blev disse data kombineret for at estimere den samlede fejl på hvert niveau og bestemme kvantificeringsgrænsen (LOQ).
Intra-dags og inter-dags upræcision
Intra-dags (n = 10) upræcision af det modificerede assay blev evalueret ved et niveau af kontrolmaterialer (0,05 μmol/L) og tre niveauer af patientprøver (0,12, 0,43, 0,82 μmol/L). På hvert niveau blev der udført 10 gentagelser. Upræcisionen mellem dagene (n = 25) blev testet på disse 4 niveauer i 5 på hinanden følgende dage og 5 replikater for hvert niveau. Alle prøverne blev udtaget fra forskellige patienter. De målte resultater blev plottet mod de forventede værdier.
Linearitet
Lineariteten blev verificeret ved at fortynde kvalitetskontrollen på 2,00 μmol/L (hc) med buffer (c0) i følgende forhold: 50 μmol/L), 1hc + 5co (0,33 μmol/L), 1hc + 9co (0,20 μmol/L), 1hc + 19co (0,10 μmol/L), 1hc + 39co (0,05 μmol/L). Hver fortynding blev analyseret tre gange, linearitetsligningen for det modificerede assay blev beregnet på grundlag af middelværdierne af de målte resultater og de forventede værdier.
LC LC-MS/MS-assayproceduren
L LC-MS/MS-assayet, der blev udført i denne undersøgelse, er som følger. Diphenhydramin blev anvendt som intern standard. Acetonitril blev anvendt som serumudfældningsmiddel for at fjerne albumin. En Hypersil ODS-BP C18-kolonne (5 μm, 2,1 × 150 mm) blev anvendt til LC-separationer. Den mobile fase var 0,1 % myresyre og acetonitril. Gradient eluering blev udført med en strømningshastighed på 0,5 mL/min ved 30 °C. MRM-tilstand (multiple reaction monitoring) blev anvendt til at detektere MTX og diphenhydramin i elektrospray-ioniseringskilde (ESI) og i positiv ionscantilstand. MTX blev detekteret ved m/z 455.0 → 308.1, diphenhydramin blev detekteret ved m/z 256.0 → 167.0 .
Metode sammenligning
Sejtteoghalvfjerdsindstyve prøver blev indsamlet fra akutte lymfoblastiske leukæmipatienter på hæmatologisk afdeling på Dalians børnehospital. Hver prøve blev testet ved hjælp af henholdsvis modificeret EMIT-assay og LC-MS/MS-assay. Resultaterne blev sammenlignet ved hjælp af simpel lineær regressionsanalyse (MedCalc Statistical Software version 15.6.1). Yderligere 45 prøver blev testet ved hjælp af modificeret EMIT-assay og kommercielt EMIT-assay til sammenligning af metoder.
Interferensundersøgelser
Triglyceridinterferens blev vurderet ved at forberede prøver med Intralipid (20 % IV-fedtemulsion). Koncentrationen af triglycerider i prøverne var 1000 ng/dL. Derefter blev der udført Paired-T-test.
Bilirubininterferens blev simuleret ved hjælp af nogle MTX-fri ikteriske plasmaprøver med en bilirubinkoncentration på ikke under 30 mg/dL.
Interferensen fra den strukturelt beslægtede metabolit 7-hydroxy-methotrexat blev vurderet ved at tilsætte forskellige niveauer af 7-hydroxy-methotrexat til plasmaprøverne, koncentrationen af MTX i disse prøver var 0,05 μmoL/L. Og testresultaterne af de aktuelle prøver blev sammenlignet med resultaterne af de oprindelige prøver .