Single-domain antistoffer, eller nanobodies, er for nylig blevet sat i søgelyset som en potentiel behandling af COVID-19. Faktisk er en COVID-19 nanobody-baseret behandling, der er udviklet af Beroni Group, en australsk bioteknologisk virksomhed, i øjeblikket ved at blive testet præklinisk. Selv om nanobodies først nu begynder at realisere deres terapeutiske potentiale, er de blevet undersøgt i årtier.
I 1989 opdagede to kandidatstuderende ved Vrije Universiteit Brussel ved et tilfælde en unik egenskab hos kamelider (kameler, lamaer og alpacaer blandt andre). Ved at teste frosset kamelblodserum fandt de studerende, at kamelider ikke kun producerer konventionelle antistoffer, men også et unikt sekundært sæt enkeltkædede antistoffer (scAbs), der består af to identiske polypeptider med tunge kæder, som hver indeholder to sammenhængende konstante domæner, et hængselområde og et variabelt domæne. (De konstante domæner i hver tung kæde løber parallelt; ud over hængselsområdet divergerer de variable domæner som armene på bogstavet “Y”). Hvert af de variable domæner i scAb’et tjener som et antigenbindende modul.
Denne spændende opdagelse var kun begyndelsen. Efterfølgende arbejde afslørede, at kun et lille fragment af scAb’et, et enkelt variabelt domæne, er nødvendigt for at genkende et antigen. Dette fragment vejer kun 12-15 kDa, deraf navnet “nanobody”.
Menneskelige antistoffer består derimod af to identiske polypeptider med tung kæde og to identiske polypeptider med let kæde. Disse proteiner er store og har en molekylvægt på ca. 150 kDa. I modsætning til camelid scAbs spænder det antigenbindende sted for menneskelige antistoffer over både den tunge og den lette kæde (eller rettere de variable domæner af disse kæder), hvilket betyder, at alle kæderne er nødvendige for at detektere et antigen.
Nanobody fordele
Da menneskelige antistoffer er store, har de ofte svært ved at få adgang til små bindingsrum på vira, visse celler og mål dybt inde i tumorvæv. De små nanobodies kan imidlertid navigere i snævre rum og kan være et attraktivt alternativ til menneskelige antistoffer for terapeutiske udviklere. Desuden er nanobodies’ bindingsdomæne langt, hvilket giver en “fingerlignende” struktur, der forbedrer nanobodies’ evne til at nå deres mål.
En stor fordel ved nanobodies i forhold til konventionelle humane antistoffer er, at de er lette at fremstille. Den relativt enkle proces starter med immunisering af en kamelid med det ønskede antigen. Kamelidens immunsystem producerer et scAb, der genkender antigenet. Derefter tages der en blodprøve fra kameliden (som ellers er uskadt), og mRNA’et for scAb’et ekstraheres fra prøven.
Generne for det variable antigenbindende domæne, dvs. nanokroppen, amplificeres derefter fra mRNA’et. Store mængder af det endelige nanobody kan derefter produceres inde i mikroorganismer, typisk Escherichia coli, til en lav pris.
Nyere metoder tager dyrene helt ud af ligningen ved at teste antigener mod et præproduceret bibliotek af nanobodies. Twist Bioscience tilbyder gennem sin Twist BioPharma-division flere typer af nanobody-biblioteker inden for en lama scAb-ramme eller en delvist humaniseret scAb-ramme. Milliarder af nanobody-sekvenser kan testes på én gang, hvilket gør antistofopdagelse og -udvikling ekstremt hurtig og relativt billig.
Nanobody-anvendelser
Originalt blev nanobodies kun eller primært anvendt til forskningsformål. Udforskningen af nanobodies’ anvendelse som terapeutiske midler er imidlertid steget dramatisk i løbet af det sidste årti. I februar 2019 blev der gjort et betydeligt fremskridt, da det første nanobody-terapeutiske lægemiddel blev godkendt af FDA.
Lægemidlet, kaldet Cablivi, blev udviklet af Ablynx til behandling af erhvervet trombotisk trombocytopenisk purpura. Cablivi virker som et anti-von Williebrand-faktor og forhindrer trombocytter i at aggregere omkring organer.
Nanobodies til forskellige tilstande er i kliniske forsøg. Nanobodies er f.eks. ved at blive evalueret som behandlinger for psoriasis, reumatoid arthritis og virusinfektioner.
Flere end at udgøre soloterapier kan nanobodies bidrage til kombinationsterapier. Af interesse er de kliniske forsøg, hvor man undersøger kombinationen af nanobodies og CAR T-cellebehandlinger (chimær antigenreceptor) mod kræft.
CAR T-celler er genetisk manipuleret til at genkende og målrette antigener på overfladen af tumorer. Indtil videre har CAR T-cellebehandlinger været meget lovende behandlinger for blodkræft, som ikke reagerer på mere konventionelle behandlinger. CAR T-cellebehandlinger har imidlertid endnu ikke været vellykkede mod solide tumorer.
For at kunne bekæmpe solide tumorer skal CAR T-celler måske finde alternative mål. De sædvanlige mål omfatter kræftspecifikke antigener, som viser sig at være svære at finde, og kræftassocierede antigener, som er lettere at finde, men som er sværere at angribe sikkert, da de også findes på sunde celler.
Disse mål udgør endnu en anden endnu en anden vanskelighed. De er normalt mål for CAR T-celler, der inkorporerer et antigen-genkendelsesdomæne, der stammer fra et humant monoklonalt antistof. Menneskelige antistoffer kan imidlertid forårsage immunogenicitet, hvilket fører til bivirkninger og en reduktion af CAR T-celleeffektiviteten.
Hvilke alternative mål kan være egnede? Mulighederne er mange i den ekstracellulære matrix, et net af proteiner, der beskytter solide tumorer og rummer immunosuppressive molekyler. Tanken om at ramme mål i den ekstracellulære matrix tiltalte forskerne på Boston Children’s Hospital. I sidste ende besluttede disse forskere at konstruere CAR T-celler med antigengengenkendelsesdomæner, der er afledt af nanobodies.
Med brug af musemodeller af kræft viste forskerne, at nanobody-baserede CAR T-celler kun er svagt immunogene og i stand til at genkende specifikke antigener i tumormikromiljøet. Til at konstruere disse CAR T-celler anvendte forskerne Gibson Assembly-metoden, en teknik, der gør det muligt at kombinere og klone flere DNA-fragmenter.
CAR T-celle-nanobody-konstruktioner er i stand til at beskadige tumorernærende blodkar og tumorbeskyttende elementer i den ekstracellulære matrix. Skaderne på tumorens mikromiljø bremser væksten betydeligt og giver andre behandlinger, f.eks. kemoterapi, adgang til det indre af tumoren.
Problemer med udvikling af nanobodier
Det tog 30 år, efter at nanobodier blev opdaget i 1989, før et nanobody-terapeutikum nåede frem til markedet. De første 10 år var fokuseret på forskning i nanobodies’ struktur, sammensætning og egenskaber. Lige efter de 10 år forsøgte Vrije Universiteit Brussel i 2001 at markedsføre nanobodies med flere patenter udstedt i virksomhedens navn. Disse patenter blev efterfølgende overdraget til Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie (VIB) og derefter til en VIB-grundlagt virksomhed, Ablynx, i 2002.
Det er sandsynligt, at begrænsninger i den intellektuelle ejendomsret vedrørende nanobodies’ stofsammensætning bidrog til den lange forsinkelse mellem opdagelsen af nanobodies og den første godkendelse af et nanobody-baseret lægemiddel. De vigtigste patentkrav på dette biomolekyle udløb imidlertid i 2014 i Europa og 2017 i USA, hvilket gjorde det muligt for Ablynx at udvide sit samarbejde med nogle af de største medicinalvirksomheder i verden betydeligt, herunder Merck & Co., Boehringer Ingelheim og Sanofi.
Disse samarbejder har resulteret i, at der er blevet registreret et væld af kliniske forsøg med nanobodies og den længe ventede godkendelse af Cablivi. Desuden har de faldende barrierer for intellektuel ejendomsret, der er forbundet med nanobodies’ stofsammensætning, gjort det muligt for endnu flere virksomheder at vise interesse for yderligere kommercialisering af disse supermolekyler.
Som med alle terapier har nanobodies ulemper. Deres lille størrelse resulterer i en hurtig clearance gennem nyrerne, hvilket reducerer deres halveringstid. For at sikre, at der er en tilstrækkelig stor mængde nanobodies til stede i blodet til at opnå den ønskede virkning, er det derfor nødvendigt med hyppig dosering, hvilket kan fremkalde nyretoksicitet. Der er også en lille risiko for, at patienterne kan få et immunrespons på terapeutiske nanobodies, da de er et biologisk materiale.
Disse problemer kan heldigvis overvindes. Forskning har vist, at fusionering af nanobodies med serumalbumin, et rigeligt transportprotein, der findes i blodet, øger nanobodies’ halveringstid betydeligt, hvilket gør det muligt for dem at forblive i blodet i længere tid og i større mængder. Nanobodies’ immunogenicitet kan reduceres ved hjælp af humanisering, en proces, der ændrer nogle af nanobodies-proteinsekvenserne for at øge deres lighed med menneskelige antistoffer, hvilket reducerer risikoen for en negativ immunreaktion.
Mens der har været forsinkelser i markedsføringen af nanobodies som terapeutika, nu hvor flere virksomheder er i stand til at investere i disse vidunderlige og unikke molekyler, forventes det, at der snart vil være en eksplosion af nanobodies, der anvendes som terapeutika for et væld af sygdomme, lige fra virusinfektioner til kræft. Kamelid-nanobodier har ikke blot bevist deres værdi, men kan også ændre landskabet inden for antistofterapi og hagle ind i en ny generation af terapeutika.