RNase A: Ofte stillede spørgsmål | AG Scientific Blog

Indledning til RNase

Ribonukleaser (RNaser) er en stor gruppe af hydrolytiske enzymer, der nedbryder ribonukleinsyre (RNA)-molekyler. Det er nukleaser, der katalyserer nedbrydningen af RNA til mindre komponenter. De er en superfamilie af enzymer, der katalyserer nedbrydningen af RNA, og som opererer på transkriptions- og translationsniveauet.

3D-konformation af ribonuklease A-enzym

Disse enzymer findes i alle levende celler og biologiske væsker, herunder prokaryoter og eukaryoter, og de udfører mange vigtige funktioner. RNaser er allestedsnærværende og har en meget kort levetid i et ubeskyttet miljø. De cytotoksiske virkninger omfatter RNA-spaltning, der fører til hæmning af proteinsyntesen og induktion af apoptose. Disse cytotoksiske virkninger kan frembringes ved at påføre RNase på cellens ydre overflade, men det er blevet konstateret, at cytotoksiciteten øges 1000 gange, når enzymet kunstigt indføres i cytosolen, hvilket tyder på internalisering i cellen som det hastighedsbegrænsende trin for toksicitet.

RNaser klassificeres som endoribonukleaser og exoribonukleaser. Endoribonukleaser er formerne A, P, H, I, III, T1, T2, U2, V1, PhyM og V.

Exoribonukleaser omfatter RNaseformerne PH, II, R, D og T samt polynukleotidphosphorylase (PNPase), oligoribonuklease, exoribonuklease I og exoribonuklease II. Disse enzymer spalter forskellige RNA-arter forskelligt.

For nylig har forskere været opmærksomme på RNaser som mulige midler til behandling af kræft. Ideen er at finde et enzym, der selektivt skader kræftceller uden at påvirke de omkringliggende normale celler.

RNase A produkter fra AG Scientific, Inc.

Ofte stillede spørgsmål om RNase A

Hvad er RNase A?

Ribonuklease A er et fordøjelsesenzym, der udskilles af bugspytkirtlen, som specifikt “fordøjer” eller hydrolyserer RNA-polymerer (men ikke DNA) ved endonuklease-spaltning af de phosphodiesterbindinger, der danner de kovalente forbindelser mellem tilstødende ribonukleotidrester i disse molekyler.

Hvad står “A” for i RNase A?

Det “A” i navnet henviser ikke til dets substratspecificitet, men til den fremherskende form af enzymet, der produceres af kvægets bugspytkirtel. RNase A er umodificeret, mens RNase B, RNase C og RNase D er blandinger af glykoformer.

På grund af dets tilgængelighed i store mængder og høje renhed har RNase A været genstand for skelsættende arbejde inden for proteinkemi og enzymologi. Desuden har cytotoksiske varianter og homologer af enzymet vist sig anvendelige som kemoterapeutiske midler.

Hvad er dette enzyms historie?

Det blev brugt af Christian Anfinsen til at bevise, at sekvensen af aminosyrer, bestemmer strukturen af et foldet protein, og det blev brugt af Stanford Moore og William Stein til at vise, at et bestemt arrangement af aminosyrer anvendes i det katalytiske center af enzymer.

Ribonuklease A var også det første enzym, der blev syntetiseret af R. Bruce Merrifield, hvilket viste, at biologiske molekyler blot er kemiske enheder, der kan konstrueres kunstigt. Alle disse centrale begreber, der blev opdaget ved hjælp af ribonuklease, blev belønnet med Nobelpriser.

Hvad er strukturen af RNase A?

RNase struktur

Den relativt lille, 124 aminosyre sekvens af RNase A, som har en molekylmasse på 12.600 Da. indeholder fire His rester, to af resterne His12 og His119 er direkte impliceret som katalytiske rester af dette enzym. Imidazolringen af His12 har en anonymt lav pK-værdi (pK < 6,0), hvilket tyder på, at den skal være deprotoneret for at kunne katalysere. Omvendt har imidazolringen af His119 en anonymt høj pK-værdi (pK > 6,0), hvilket tyder på, at den skal protoneres for at kunne katalysere.

Er Ribonuklease A et protein?

RNase A er et lille protein, det modne enzym har kun 124 aminosyrerester, uden at der er knyttet kulhydrat til det. I modsætning til andre enzymer indeholder RNase A 19 af de 20 syrer og mangler kun tryptofan.

Hvad er virkningsmekanismen?

His12 fungerer som en generel base, der accepterer 2′-OH-protonen fra den sessile ribonucleinsukkerring. Dette fremmer et nukleofilt angreb fra 2′-O på det mere positivt ladede fosforatom (P) og skaber derved et 2′-,3′-cyklisk ribonukleotidphosphatintermediat. Dannelsen af dette mellemprodukt fremmes af imidazolet i His119, der fungerer som en generel syre og afgiver sin proton til oxygenatomet i den modtagelige P-O-R’-binding.

For det andet trin af reaktionen omvendes de generelle syre- og baseaktiviteter af sidekæderne i disse to His-rester. His12 virker som en generel syre, der donerer sin nyligt erhvervede proton til det 2′-,3′-cykliske ribonucleotidfosfatintermediat, mens His119, der virker som en generel base, accepterer en proton fra vand for at fremme hydroxylangreb på det samme 2′-,3′-cykliske intermediat.

Hvad er RNase A’s spaltningssted?

RNase A hydrolyserer effektivt RNA-forureninger i DNA-præparater ved at spalte fosfodiesterbindingen mellem 3′-fosfatgruppen i et pyrimidinnukleotid (C og U) og 5′-ribose i det tilstødende nukleotid 1, 2, 3. Den mellemliggende 2′-,3′-cykliske phosphodiester, der dannes, hydrolyseres derefter yderligere til en 3′-monofosfatgruppe. Bovin pancreatisk RNase A er et meget stabilt protein på 124 aminosyrer med den højeste målte aktivitet over for enkeltstrenget RNA og en to gange hurtigere spaltningshastighed ved cytidinrester sammenlignet med uridylrester.

Hvad er RNase A’s syre/base-katalysereaktion?

RNase A anvender også syre/base-katalyse til kemisk at ændre sine substrater. Syre- eller basiske rester af enzymet overfører protoner til eller fra reaktanten for at stabilisere de udviklende ladninger i overgangstilstanden. Overførslen af protoner skaber normalt bedre afgangsgrupper, hvilket gør reaktionen mere energimæssigt gunstig.

Histidin er en meget almindelig aminosyrerest, der er involveret i katalyse, da histidin har en pKa-værdi tæt på neutral, (pKa=6); derfor kan histidin både acceptere og afgive protoner ved fysiologisk pH.

Hvad er stabiliteten af Ribonuklease A?

Ribonuklease A er utrolig stabil. I en fremgangsmåde til oprensning af ribonuklease A fra pancreas fra køer behandles ekstrakterne f.eks. med svovlsyre og opvarmes derefter næsten til kogepunktet, og ribonuklease A er den eneste ting, der overlever. Dette er ikke overraskende, da det udskilles af bugspytkirtlen og skal udføre sit arbejde i det ugæstfrie miljø i fordøjelseskanalen. Ribonuklease A’s stabilitet skyldes i høj grad fire disulfidbindinger, der limer forskellige dele af kæden sammen.

For at bevare stabiliteten skal produktet generelt opbevares og håndteres i overensstemmelse med leverandørens anvisninger.

Hvordan inaktiveres RNase A?

RNase A er et ret stabilt enzym og indeholder 4 disulfidbroer, som forekommer i alle pattedyrs ribonukleaser fra bugspytkirtlen. Når broerne brydes reduktivt, denatureres proteinet og bliver inaktivt. Ved reoxidation foldes proteinet igen, og fuld aktivitet genoprettes. Det er imidlertid muligt kun at reducere broerne delvist og bevare enzymaktiviteten. Fjernelse af 4 peptider ved carboxylterminus ødelægger enzymaktiviteten.

Hvad hæmmer RNase A?

Uridinvanadat er en potent kompetitiv hæmmer af RNase A. Det, der gør det så potent, er, at dets struktur efterligner en overgangstilstand, som er et mellemprodukt i reaktionen.

Hvordan fremstilles RNase A fra lager?

RNase A fremstilles typisk ved at koge lageret i 10 minutter for at fjerne den kontaminerende DNase-aktivitet uden at påvirke RNasen. Opvarmning til 65 °C påvirker ikke RNaser.

Hvordan rekonstitueres det tilberedte lager af RNase A?

RNase A kan opløses i en koncentration på 1 til 10 mg/ml i 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 15 mM NaCl, opvarmes til 100 °C i 15 minutter for at inaktivere kontaminerende DNaser og afkøles langsomt til stuetemperatur og fordeles i alikvater.

Hvad er arbejdskoncentrationen af dette enzym?

Den anbefalede arbejdskoncentration af RNase A er 1 til 100 µg/mL afhængigt af anvendelsen. Enzymet er aktivt under et bredt spektrum af reaktionsbetingelser. Ved lave saltkoncentrationer (0 til 100 mM NaCl) spalter RNase A enkeltstrenget og dobbeltstrenget RNA samt RNA-strengen i RNA-DNA-hybrider.

Hvad er opbevaringstemperaturen og håndteringsforanstaltningerne for dette produkt?

Lagres i tæt forseglet hætteglas ved -20ºC. Når den er åbnet, dehydreres den over silicagel under vakuum, inden den returneres til -20ºC. Der skal udvises forsigtighed ved håndtering. Brug ikke dette stof, hvis du ikke er fuldt uddannet eller ikke er klar over de involverede farer.

Hvad er anvendelsesmulighederne for RNase A?

RNaser har vigtige roller i RNA-nedbrydning og -omsætning i alle organismer. Ribonukleaseenzym kan afvikle RNA-helixen ved at kompleksere med enkeltstrenget RNA.

RNase A er en endoribonuklease med funktioner i RNA-metabolisme og regulering af genekspression.

RNase A har vist sig at spille vigtige roller i sygdomme såsom autoimmune sygdomme, nyreinsufficiens og bugspytkirtelsygdomme. For nylig blev der også rapporteret om en anti-tumoraktivitet for en RNase A med cytotoksiske og cytostatiske egenskaber. Medlemmerne af RNase A-superfamilien er vidt udbredt og findes i serum og væv hos pattedyr.

Enzymet kan anvendes til at hydrolyserer RNA fra proteinprøver. Det er kompatibelt til brug i RNase protection assays, til fjernelse af uspecifikt bundet RNA, til analyse af RNA-sekvenser, til hydrolyse af RNA indeholdt i proteinprøver og til DNA-rensning.

Hvad er dette produkts udseende/form?

Leveres som et hvidt kromatografisk renset, saltfrit, frysetørret pulver. Udseende/form af produktet kan variere afhængigt af producenten.

Tilbehør til læsning

• Kilder til DNA-kontaminering i laboratoriet
• Guanidinthiocyanat i RNA-lysisbuffere
• 8 Fordele ved at vælge AGS som din Proteinase K-leverandør