Instrument and reagents
MTX検出器にはオープンチャンネルがありパラメータカスタマイズができるSiemens VIVA-E（Simple Viva）を使用した． MTXの試薬と校正物質はSiemens (6L119UL) から購入した。
3段階のQC物質はBio-Rad (Irvine, CA) から、0.05 μmol/LのカスタムQC物質はAladdin (Shanghai, China) から追加購入した。
MTX法の比較は、Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) assay (LC-20 AD Liquid Chromatography, and AB SCIEX QTRAP®4500 Mass Spectrometers) による同一サンプルの分析で実施しました。
サンプル
試験サンプルは大連の子供病院の血液病棟から取得したものでした。 また，トリグリセリドとビリルビンの干渉を調べるために，一部の検査検体とMTX未使用の黄疸血漿検体を採取した。
試薬調製
シーメンス試薬キットには、抗体/基質試薬A、酵素試薬B、Emit Drug Assay Buffer Concentrate、およびEmit Methotrexate Calibratorsが含まれています。 試薬AおよびBを3.0 mLの脱イオン水で再構成し、穏やかに旋回して混合し、室温で1時間平衡化しました。 試薬AおよびBの作業溶液は、ストック溶液を緩衝液で1:9 v/vに希釈して調製しました。1.50および2.00μmol/Lは、それぞれ1.50および2.00mLの脱イオン水で1.00μmol/Lに再構成されたもので、製造元の指示に従い、0.20, 0.50, 1.00 μmol/Lの校正物質を使用しました。 その後、0.20 μmol/Lのキャリブレーターを0.05 μmol/Lに、1.00 μmol/Lを0.10 μmol/Lと0.25 μmol/Lに希釈した。
Viva-E装置のプログラミング
Viva-Eのオープンチャンネルで試薬A & Bの容量を180μLから110μL（110μLはMTX試薬のViva-Eの下限）へ変更するようにプログラミングしました。 6点検量線は修正3次スプライン回帰でプログラムされました。 キットで提供される6つの校正物質は、0、0.20、0.50、1.00、1.50および2.00μmol/Lであった。 試薬A、Bの容量を減らすと、1μmol/L以上の試料では十分に反応しなくなりました。 その結果、modified EMIT assayの新しいキャリブレーターセットは0, 0.05, 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 μmol/Lの範囲で0.05から1.00 μmol/Lに変更されました。
市販キットの説明書によれば、1.00 μmol/L以上の濃度の試料は検量線の範囲に薄めなければならないそうです（0。
Limit of blank, limit of detection, limit of quantitation
Limit of blank (LOB), limit of detection (LOD), limit of quantitation (LOQ) はCLSI EP17-A に従って測定されました。 LOBは6検体（S1～S6，10日間10反復）を用いて測定した。 S1とS2は異なるキャリブレーターロットのゼロキャリブレーター、S3とS4は希釈剤、S5とS6はブランク血漿です。 LODは、LOBからLOBの4倍までの5つの低レベルサンプルプールで測定されました（12日間で12回複製）。 LOBとLODは2ロットの試薬で測定した。 臨床要件に基づき、全誤差の目標は20％に設定されました。 LODの試験結果をもとに，各レベルの偏りや不正確さを推定した。 また，LOD試験の結果をもとに，各濃度における偏りや不正確さを推定し，定量下限値（LOQ）を決定した． 各レベルで、10回の複製を実施した。 日間（n = 25）の不正確性は，これら4つの水準で連続5日間，各水準について5回の複製で検査した。 試料はすべて異なる患者から得たものである。 測定結果は期待値に対してプロットした。
直線性
直線性は、2.00 μmol/L (hc) の品質管理品を以下の比率で緩衝液 (c0) で希釈して検証した。 1hc + 1c0 (1.00 μmol/L), 2hc + 3c0 (0.80 μmol/L), 1hc + 2co (0.67 μmol/L), 1hc + 3co (0. 06 μmol/L)。50μmol/L）、1hc＋5co（0.33μmol/L）、1hc＋9co（0.20μmol/L）、1hc＋19co（0.10μmol/L）、1hc＋39co（0.05μmol/L）です。 各希釈液を3回分析し、測定結果の平均値と期待値からmodified assayの直線性式を算出しました。
LC-MS/MS測定手順
本研究で行ったLC-MS/MS測定は、以下の通りです。 内部標準物質としてジフェンヒドラミンを使用した。 血清沈殿剤にはアセトニトリルを用い、アルブミンを除去した。 LC分離にはHypersil ODS-BP C18 (5 μm, 2.1 × 150 mm) カラムを使用した。 移動相は0.1%ギ酸とアセトニトリルを使用した。 グラジエント溶出は流速0.5 mL/min、30 ℃で行った。 エレクトロスプレーイオン化（ESI）ソースとポジティブイオンスキャンモードでMTXとジフェンヒドラミンを検出するためにMRM（Multiple Reaction Monitoring）モードを使用しました。 MTXはm/z 455.0 → 308.1，ジフェンヒドラミンはm/z 256.0 → 167.0 で検出された。
方法比較
大連児童医院の血液病棟で急性リンパ性白血病患者から79サンプルを採取した。 各サンプルはmodified EMIT assayとLC-MS/MS assayでそれぞれ検査された。 結果は、単純な線形回帰分析（MedCalc統計ソフトウェアバージョン15.6.1）を用いて比較されました。 また、比較のため、45検体についてEMIT測定法と市販のEMIT測定法を用いて試験を行いました。
干渉試験
トリグリセリドの干渉は、Intralipid (20% IV fat emulsion) でサンプルを調製して評価しました。 検体中のトリグリセリド濃度は1000ng/dLとした。 ビリルビン干渉は、ビリルビン濃度が30 mg/dL以下のMTX非添加黄疸血漿サンプルを用いてシミュレーションした。 そして，今回の検体の検査結果を元の検体の検査結果と比較した.
。