Tabell 1
Excitering, emission och ljusstyrka
Om du planerar att använda flera fluorescerande taggar är det viktigt att välja en med tydliga emissionstoppar – liksom excitationstoppar som du kan rikta in dig på med dina tillgängliga lasrar. Om emissionstopparna överlappar varandra blir det svårt, eller möjligen omöjligt, att skilja dem åt.
Du vill vanligtvis ha den ljusaste fluorescerande taggen inom dina tillgängliga spektrum för att uppnå en tydlig signal och övervinna eventuell bakgrundsfluorescens. Ljusstyrkan är en produkt av proteinets extinktionskoefficient och kvantutbyte. Det resulterande talet kan dock vara svårt att tolka, därför är en fluorescerande taggs ljusstyrka i förhållande till en väldefinierad tagg, som EGFP, ett vanligt alternativt mått.
Maturering och blekning
Maturering definierar hur lång tid det tar för en fluorescerande tagg att veckas korrekt, bilda kromoforen och börja fluorescera. För tidskänsliga händelser i levande celler kan en kort mognadstid vara viktig. Superfolder GFP (sfGFP) kan till exempel veckas på mindre än 10 minuter, medan mOrange kan ta över fyra timmar.
Blekning är ett mått på fotostabiliteten, dvs. hur lång tid efter excitering kromoforen förlorar förmågan att sända ut ljus. Om du planerar att utföra långvariga tidsstegsexperiment bör du överväga en tagg med hög fotostabilitet. T-safir har en halveringstid för blekning (t½; tid för en initial emissionshastighet på x fotoner/s att minska till hälften) på 25 sekunder, men EGFP är mycket stabilare, med en blekningstid t½ på 174 sekunder.
Miljöförhållanden
Likt de flesta proteiner påverkas fluorescerande taggar av pH, temperatur och syrehalter. Beroende på vilken miljö du planerar att använda kan du antingen behöva justera förhållandena något eller välja en mer lämplig tagg.
PH kan påverka excitations- och emissionstoppar, och majoriteten av fluorescerande taggar är känsliga för syra: vissa kan till och med ändra fluorescerande intensitet vid pH-ändringar (t.ex. pHTomato). PKa-värdet är en bra indikator på pH-känslighet eftersom det visar vid vilket pH-värde hälften av kromoforerna är fluorescerande.
Temperatur och syrenivåer påverkar båda mognadstiderna: hypoxiska förhållanden tenderar att fördröja mognadstiderna, liksom temperaturer som ligger utanför det optimala området för den fluorescerande taggen (t.ex. EGFP har optimerats för att fungera vid 37 °C). Nyare fluorescerande taggar som UnaG, en GFP som isolerats från den japanska sötvattensålen (Anguilla japonica), fluorescerar även när syrehalten är låg3.
Kodonoptimering
Då de flesta fluorescerande taggar härstammar från manet- eller korallproteiner, snarare än från något som liknar däggdjursceller och -vävnader som du troligen kommer att använda dem i, kan det finnas en skillnad mellan arter när det gäller de aminosyrakodoner som används. Detta kan leda till dåligt uttryck och därmed låg signal.
Troligtvis har många av de nyare versionerna av fluorescerande taggar kodonoptimerats för att återspegla preferenser för däggdjursceller. I GFP till exempel förbättrade Jürgen Haas och kollegor signalen 40-120 gånger genom att modifiera GFP-kodonsekvensen4.
Om du använder en äldre plasmid för att generera dina fusionsproteiner kanske den inte innehåller någon modifierad fluorescerande taggsekvens. Kontrollera därför alltid om din sekvens har modifierats för användning i en viss art.
Oligomerisering
Det är viktigt att avgöra om din tagg är en monomer eller dimer (monomerer betecknas vanligen med ett ”m” som föregår proteinnamnet, t.ex. mCherry), och om detta påverkar ditt experiment eller inte. Många av de tidiga fluorescerande taggarna var benägna att bilda oligomerer, och oligomerisering kan påverka fusionsproteinets biologiska funktion. EGFP är till exempel en monomer som kan bilda dimerer när den används i tillräckligt höga koncentrationer, vilket kan förvränga subcellulära organeller5 eller störa experiment som FRET6. Riktigt monomera FP rekommenderas i de allra flesta fall.
GFP- och mCherry-produkter