Instrument och reagenser
Instrumentet för MTX-detektering var Siemens VIVA-E, vilket gör det möjligt att anpassa parametrarna tack vare tillgången till en öppen kanal. MTX-reagens och kalibratorer köptes från Siemens (6L119UL).
Tre nivåer av kvalitetskontrollmaterial (QC) köptes från Bio-Rad (Irvine, CA), ytterligare ett anpassat QC-material på 0,05 μmol/L från Aladdin (Shanghai, Kina).
MTX-metodjämförelse utfördes genom att analysera samma prover med hjälp av analys med vätskekromatografi-tandem-masspektrometri (LC-MS/MS) (LC-20 AD-vätskekromatografi och AB SCIEX QTRAP®4500-masspektrometrar).
Prover
Testproverna hämtades från den hematologiska avdelningen på Dalians barnsjukhus. Några testade prover och MTX-fria ikteriska plasmaprover samlades in för att studera triglycerid- och bilirubininterferens. Det gjordes inga ingrepp i patienternas behandling och ingen av patienternas individuella information nämndes.
Reagensberedning
Siemens Reagenskit innehåller Antikropps-/substratreagens A, enzymreagens B, Emit Drug Assay Buffer Concentrate och Emit Methotrexate Calibrators. Reagens A och B rekonstituerades med 3,0 ml avjoniserat vatten, blandades genom försiktig omrörning och ekvilibrerades vid rumstemperatur i 1 timme. MTX-buffertkoncentratet blandades med avjoniserat vatten (1:15 v/v). Arbetslösning av reagens A och B framställdes genom att spädning av lagerlösningar 1:9 v/v med buffertlösning.
Vissa kalibratorer (0, 0,20, 0,50, 1,00 μmol/L) rekonstituerades till angiven koncentration med 1.0 mL avjoniserat vatten enligt tillverkarens anvisningar, andra kalibratorer 1,50 och 2,00 μmol/L rekonstituerades till 1,00 μmol/L med 1,50 respektive 2,00 mL avjoniserat vatten. Därefter späddes kalibratorn 0,20 μmol/L till 0,05 μmol/L och kalibratorn 1,00 μmol/L späddes till 0,10 och 0,25 μmol/L. Den nya uppsättningen kalibratorer (0, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50 och 1,00 μmol/L) uppfyller kraven för den modifierade kalibratorkurvan.
Programmering av Viva-E-instrumentet
En öppen kanal på Viva-E programmerades så att volymerna av reagens A & B ändrades från 180 μL till 110 μL (110 μL är den nedre gränsen för Viva-E för MTX-reagens). En kalibreringskurva med sex punkter programmerades med modifierad kubisk splineregression. De sex kalibratorer som tillhandahålls av satsen var 0, 0,20, 0,50, 1,00, 1,50 och 2,00 μmol/L. När volymerna av reagens A och B minskades var de inte tillräckliga för att reagera med prover som var större än 1 μmol/L. Därför ändrades den nya kalibreringsuppsättningen för den modifierade EMIT-analysen till 0, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 μmol/L inom ett intervall på 0,05 till 1,00 μmol/L.
Enligt instruktionen för det kommersiella kitet ska proverna med en koncentration på mer än 1,00 μmol/L spädas ut till kalibreringskurvans omfattning (0.05-1,00 μmol/L) med hjälp av en utspädningsfaktor på 10, 100 eller 1000.
Blankningsgräns, detektionsgräns, kvantifieringsgräns
Blankningsgräns (LOB), detektionsgräns (LOD), kvantifieringsgräns (LOQ) bestämdes enligt CLSI EP17-A . LOB bestämdes med hjälp av sex prover (S1-S6, 10 upprepningar under 10 dagar): S1 och S2 var nollkalibratorer från två olika kalibratorpartier, S3 och S4 var spädningsmedel, S5 och S6 var blank plasma. LOD-analysen gjordes med fem provpooler med låg nivå som varierade från LOB till fyra gånger LOB (12 replikat under 12 dagar). LOB och LOD bestämdes med två reagenspartier. Enligt de kliniska kraven sattes målet för det totala felet till 20 %. Testresultaten från LOD-studien användes för att uppskatta bias och imprecision för varje nivå av analyten. Därefter kombinerades dessa data för att uppskatta det totala felet på varje nivå och bestämma kvantifieringsgränsen (LOQ).
Intradag och interdag imprecision
Intradag (n = 10) imprecisionen hos den modifierade analysen utvärderades av en nivå av kontrollmaterial (0,05 μmol/L) och tre nivåer av patientprover (0,12, 0,43, 0,82 μmol/L). På varje nivå utfördes 10 upprepningar. Oprecisionen mellan dagarna (n = 25) testades på dessa fyra nivåer under fem på varandra följande dagar och fem upprepningar för varje nivå. Alla proverna togs från olika patienter. De uppmätta resultaten plottades mot de förväntade värdena.
Linearitet
Lineariteten verifierades genom att kvalitetskontrollen på 2,00 μmol/L (hc) späddes ut med buffert (c0) i följande proportioner: 1hc + 1c0 (1,00 μmol/L), 2hc + 3c0 (0,80 μmol/L), 1hc + 2co (0,67 μmol/L), 1hc + 3co (0,80 μmol/L), 1hc + 2co (0,67 μmol/L), 1hc + 3co (0,80 μmol/L).50 μmol/L), 1hc + 5co (0,33 μmol/L), 1hc + 9co (0,20 μmol/L), 1hc + 19co (0,10 μmol/L), 1hc + 39co (0,05 μmol/L). Varje utspädning analyserades tre gånger, linjäritetsekvationen för den modifierade analysen beräknades baserat på medelvärdena för de uppmätta resultaten och de förväntade värdena.
Lc-MS/ms-analysförfarandet
Lc-MS/ms-analysen som utfördes i den här studien är som följer. Difenhydramin användes som intern standard. Acetonitril användes som serumutfällningsmedel för att eliminera albumin. En Hypersil ODS-BP C18-kolonn (5 μm, 2,1 × 150 mm) användes för LC-separationerna. Den rörliga fasen bestod av 0,1 % myrsyra och acetonitril. Gradienteluering utfördes med en flödeshastighet på 0,5 mL/min vid 30 °C. MRM-läget (multiple reaction monitoring) användes för att detektera MTX och difenhydramin i elektrosprayjoniseringskällan (ESI) och i positivt jonavsökningsläge. MTX detekterades vid m/z 455,0 → 308,1, difenhydramin detekterades vid m/z 256,0 → 167,0 .
Metodjämförelse
Sjuttionio prover samlades in från patienter med akut lymfoblastisk leukemi på den hematologiska avdelningen vid Dalians barnsjukhus. Varje prov testades med hjälp av modifierad EMIT-analys respektive LC-MS/MS-analys. Resultaten jämfördes med hjälp av enkel linjär regressionsanalys (MedCalc Statistical Software version 15.6.1). Ytterligare 45 prover testades med modifierad EMIT-analys och kommersiell EMIT-analys för metodjämförelse.
Interferensstudier
Triglyceridinterferens bedömdes genom att preparera prover med Intralipid (20 % IV-fettemulsion). Koncentrationen av triglycerider i proverna var 1000 ng/dL. Därefter utfördes Paired-T-testet.
Bilirubininterferens simulerades med hjälp av några MTX-fria ikteriska plasmaprover med en bilirubinkoncentration som inte var lägre än 30 mg/dL.
Interferensen från den strukturellt besläktade metaboliten 7-hydroximetotrexat utvärderades genom att tillsätta olika nivåer av 7-hydroximetotrexat till plasmaproverna, MTX-koncentrationen i dessa prover var 0,05 μmoL/L. Och testresultaten av de aktuella proverna jämfördes med resultaten av de ursprungliga proverna .