- Les systèmes de chromatographie liquide-spectrométrie de masse quadripolaire en tandem
- Développement de la méthode d’extraction en phase solide
- La stabilité du diazépam et du nordiazépam dans les échantillons aqueux acides et neutres
- Les récupérations de l’extraction en phase solide pour les échantillons d’eau environnementale simulés, conservés à faible pH de l’échantillon
- Régénération du nordiazépam pendant la préparation des échantillons
- Validation de la méthode
- Quantification du diazépam et du nordiazépam dans les échantillons d’eau environnementale
Les systèmes de chromatographie liquide-spectrométrie de masse quadripolaire en tandem
Les systèmes d’élution isocratique ainsi que les systèmes d’élution en gradient développés ont donné une bonne résolution des pics (Rs ≥ 3,1) pour le diazépam et le nordiazépam. Dans le système isocratique, les temps de rétention étaient de 2,6 min (0,54 RSD %) et 4,1 min (0,27 RSD %) pour les standards de nordiazépam-d5 et de diazépam-d5, respectivement. Dans la matrice d’eau de surface, les temps de rétention étaient les mêmes que pour les standards et les valeurs RSD étaient de 0,62 % et 0,30 % pour le nordiazépam-d5 et le diazépam-d5, respectivement. Les temps de rétention des étalons de travail dans le système à gradient étaient de 2,4 min (0,90 RSD %) et de 2,9 min (0,70 RSD %) pour le nordiazépam et le diazépam, respectivement. La précision des temps de rétention des composés dans les eaux usées traitées est indiquée dans le tableau 1, où les valeurs RSD étaient ≤ 0,35 %.
Le diazépam et le nordiazépam ont été identifiés dans les échantillons d’eaux usées traitées par leurs transitions MS/MS et leurs temps de rétention caractéristiques (tableau 1). Un ion précurseur et deux ions fragments ont été suivis pour chaque composé. Pour l’identification du diazépam et du nordiazépam d’origine » naturelle « , les rapports des surfaces des pics obtenus à partir des deux ions fragments ont été comparés à ceux des normes (Tableau 1). De plus, les temps de rétention des composés cibles ont été comparés aux temps de rétention du diazépam-d5 et du nordiazépam-d5 dans le même passage chromatographique.
Développement de la méthode d’extraction en phase solide
La stabilité du diazépam et du nordiazépam dans les échantillons aqueux acides et neutres
Les échantillons d’eau environnementaux collectés sont généralement stockés à un pH acide avant l’analyse des contaminants émergents . Dans la présente étude, la stabilité du diazépam et du nordiazépam ont été étudiés lorsqu’ils sont stockés en tant que normes de travail (à pH 3,1 et pH 7,0). Il a été constaté que le nordiazépam était fortement dégradé lorsqu’il était stocké dans la solution acide à température ambiante. En 12 jours, 56% du nordiazépam était dégradé (Fig. 2). La dégradation n’était pas aussi importante lorsque la solution de travail était stockée à 4 °C ; après 12 jours, 20% de la concentration initiale de nordiazépam était dégradée. D’autre part, le diazépam s’est avéré stable à pH 3,1 lorsqu’il a été stocké à température ambiante et à 4 °C (Fig. 2). Au cours des 12 jours, seuls 0,53% et 3,1% du diazépam ont été dégradés à température ambiante et à 4 °C, respectivement. Les deux composés se sont révélés stables pendant 12 jours à pH neutre. Au jour 12, les réponses pour le diazépam et le nordiazépam (lorsqu’ils sont conservés à 4 °C et à la température ambiante) étaient de 101-103 % des réponses initiales. Les valeurs RSD (n = 3) pour la concentration déterminée à différents points dans le temps étaient ≤ 5,1 %. La réaction a été initialement découverte dans des échantillons d’eaux usées mais les expériences ont été réalisées dans des solutions préparées pour simplifier les conditions et réduire la possibilité d’autres réactions/effets dans les matrices très complexes des eaux usées.
La stabilité du diazépam et du nordiazépam dans l’acide formique 5 mM dans l’eau purifiée, pH 3. Diazépam stocké à 4 °C (triangle blanc) et à température ambiante (triangle noir). Nordiazépam conservé à 4 °C (carré blanc) et à température ambiante (carré noir). Les détails expérimentaux sont décrits dans « Études de stabilité du diazépam et du nordiazépam dans des solutions aqueuses acides et neutres »
Nos résultats montrent que le nordiazépam est instable à pH 3, ces résultats sont en accord avec les résultats de la littérature qui montrent que le nordiazépam subit une hydrolyse dans les solutions acides. Archontaki et al. ont trouvé que le nordiazépam était hydrolysé dans des solutions aqueuses acides et que la première étape de la dégradation était réversible. Cependant, les résultats de la présente étude peuvent sembler contraires aux résultats d’une étude récente où il a été constaté que le nordiazépam (et le diazépam) étaient plus stables à pH 2 qu’à pH 7 . Cette différence est en fait attendue si l’on considère les différentes stratégies de détermination de la récupération. Puisque la transformation du nordiazépam est inversée pendant l’évaporation et le chauffage, il n’y a pas d’implication pratique pour l’utilisation de routine de la méthode. Ce n’est que lorsque la récupération est estimée selon les recommandations de Matuszewski et al. en combinaison avec l’instabilité du nordiazépam à faible pH que nous obtenons une perte du composé et donc une récupération élevée apparente.
Les récupérations de l’extraction en phase solide pour les échantillons d’eau environnementale simulés, conservés à faible pH de l’échantillon
Les récupérations de l’extraction en phase solide et l’effet de matrice ont été déterminés dans les échantillons d’eau traitée par LC-MS en utilisant l’approche suggérée par Matuszewski et al, les détails sont donnés dans « Validation de la méthode ». Les taux de récupération après extraction ont été déterminés pour les étalons marqués aux isotopes, le diazépam-d5 et le nordiazépam-d5, car les composés marqués ne sont pas censés se trouver dans les matrices environnementales. Dans la présente étude, les étalons de travail du diazépam-d5 et du nordiazépam-d5 ont été conservés dans de l’acide formique 5 mM dans de l’eau purifiée pH 3,1/acétonitrile (90/10, v/v), pendant une semaine maximum à 8 °C, et ont été utilisés pour préparer les ensembles A-C.
Les récupérations d’extraction relatives, déterminées à une concentration faible et une concentration élevée, sont indiquées dans le tableau 2 (la méthode d’extraction est indiquée dans « Préparation des échantillons et extraction en phase solide »). Les récupérations d’extraction étaient plus élevées pour le nordiazépam-d5 que pour le diazépam-d5. Pour le nordiazépam-d5, les récupérations d’extraction relatives étaient de 114 ± 8,1 % et 117 ± 21 % à la concentration faible et élevée, respectivement. Les valeurs RSD obtenues pour le diazépam-d5 étaient de 6,0 % et 24 % pour la concentration faible et élevée, respectivement (tableau 2). Des valeurs élevées de RSD (≥ 18%) pour la procédure d’extraction en phase solide sont parfois obtenues lors de déterminations à l’état de traces dans des matrices complexes . En outre, des récupérations d’extraction élevées (≥ 100 %) pour le nordiazépam dans des échantillons d’eau environnementale ont été rapportées dans la littérature précédemment . Comme nous le verrons plus loin, ces récupérations élevées pourraient être corrélées à un équilibre chimique entre le nordiazépam et un produit de transformation.
La récupération absolue par extraction pour le nordiazépam-d5 a été déterminée à 139 ± 21% et l’effet de matrice à 119 ± 3,0%. La récupération élevée de l’extraction absolue pour le nordiazépam-d5 peut s’expliquer en partie par le fait que le nordiazépam-d5 a été soumis à un renforcement des ions dans l’interface MS. Cependant, nous avons montré que les récupérations d’extraction élevées (> 100% pour l’extraction relative, comme discuté ci-dessus) n’étaient pas seulement dues à des effets de matrice dans la source ESI. Cela a été déterminé par les récupérations d’extraction relatives obtenues selon Matuszewski et al. où les échantillons extraits et non extraits ont été injectés dans le système LC-MS/MS dissous dans la même matrice. De plus, pour vérifier que les taux de récupération élevés ne sont pas liés à un processus quelconque dans l’interface du spectromètre de masse, les taux de récupération pour le diazépam-d5 et le nordiazépam-d5 ont été déterminés en utilisant une seconde technique de détection, la LC-UV. La récupération pour un échantillon extrait de nordiazépam-d5 dans un tampon phosphate (pH 7,0) analysé à la fois par LC-MS/MS et LC-UV a été déterminée comme étant de 159 et 153% (n = 2), respectivement. Nous avons conclu que les récupérations d’extraction élevées pour le nordiazépam n’étaient pas attribuées, dans une large mesure, à un quelconque processus dans le spectromètre de masse.
En conclusion, même si les récupérations d’extraction obtenues et les valeurs RSD étaient élevées, elles apparaîtraient probablement comme raisonnables car les concentrations des composés cibles étaient faibles (50 et 250 pM) et parce que les composés ont été extraits d’une matrice complexe. Dans cette étude, nous avons voulu démontrer que ces récupérations élevées obtenues pour le nordiazépam pouvaient être corrélées à un équilibre chimique entre le nordiazépam et un produit de transformation trouvé par Archontaki et al. .
Régénération du nordiazépam pendant la préparation des échantillons
Lorsque des solutions stockées de diazépam et de nordiazépam (pH 3.1, à température ambiante, « La stabilité du diazépam et du nordiazépam dans les échantillons aqueux acides et neutres ») ont été utilisées pour piquer le tampon phosphate et ensuite soumises à une extraction en phase solide, les réponses obtenues à partir des extraits reconstitués de nordiazépam étaient plus grandes par rapport aux réponses obtenues à partir des solutions stockées non extraites. Par l’extraction en phase solide, la surface du pic du nordiazépam avait augmenté de 26 comptes de surface (2,7 RSD %, n = 3) à 45 comptes de surface (14,6 RSD %, n = 3).
Afin de vérifier que le nordiazépam a été régénéré pendant l’extraction en phase solide, un échantillon stocké de nordiazépam-d5 (donnant une aire de pic de 1470 pour l’ion fragment de m/z 213) et un échantillon traité de nordiazépam-d5 (avec une aire de pic de 1790) ont été injectés dans le système LC-MS/MS. En plus du canal SRM du nordiazépam-d5 (276 → 213), deux autres canaux SRM ont été acquis, tableau 1. Les échantillons stockés de nordiazépam-d5 ont été injectés (n = 6) et les rapports des transitions SRM ont été déterminés comme étant de 1,4 (3,8 RSD %, rapport des ions fragmentés de m/z (276 → 213)/(276 → 165) et de 1,0 (3,5 RSD %, rapport des ions fragmentés de m/z (276 → 213)/(276 → 140). Pour l’échantillon traité de nordiazépam-d5, les rapports des transitions SRM étaient les mêmes, c’est-à-dire 1,4 et 1,0. Ainsi, il n’y avait pas de différences significatives dans les ratios d’ions fragmentés entre les échantillons stockés et les échantillons traités. De plus, les temps de rétention étaient les mêmes pour les deux échantillons. On en a conclu que c’est le nordiazépam-d5 qui a été détecté dans les échantillons stockés et traités.
Archontaki et al. ont constaté que le nordiazépam était transformé dans une solution aqueuse acide, en l’intermédiaire N-(2-benzoyl-4-chlorophényl)-2-aminoacétamide avec la formule moléculaire C15H13N2O2Cl et la masse monoisotopique 288,1 Da. Le produit de transformation a été cristallisé et analysé par LC-UV, GC-MS, 1H- et 13C-NMR, et spectroscopie IR. L’équilibre chimique de l’intermédiaire et du nordiazépam était réversible, mais la transformation ultérieure de l’intermédiaire en produit de dégradation final (C13H10NOCl) n’était cependant pas réversible. Dans la présente étude, un ion avec un temps de rétention de 3,0 min et un rapport masse/charge de 289,0 a été détecté par LC-MS dans une solution stockée (pH 3,1) de nordiazépam. Cet ion pourrait correspondre au + du produit de transformation du nordiazépam. En outre, le profil isotopique de l’ion à 3,0 min correspondait au profil isotopique d’un atome de chlore. En outre, le pic chromatographique a été élué avant le nordiazépam, ce qui est conforme aux résultats des séparations du nordiazépam et du N-(2-benzoyl-4-chlorophényl)-2-aminoacétamide dans le système à phase inversée utilisé par Archontaki et al. Ainsi, le pic détecté dans la solution d’eau acide stockée, dans cette étude, était très probablement le N-(2-benzoyl-4-chlorophényl)-2-aminoacétamide. De plus, le rapport entre la surface du pic du nordiazépam et du N-(2-benzoyl-4-chlorophényl)-2-aminoacétamide était de 0,75 (n = 2) dans cette solution d’eau stockée dans l’étude présentée. Dans les mélanges de méthanol évaporés (détails expérimentaux décrits dans « Études de stabilité du diazépam et du nordiazépam dans des solutions aqueuses acides et neutres »), le rapport de l’aire de pic du nordiazépam au N-(2-benzoyl-4-chlorophényl)-2-aminoacétamide a cependant augmenté à 1,9 (6,8 RSD %, n = 4), c’est-à-dire, l’aire du pic du nordiazépam a augmenté et l’aire du pic du N-(2-benzoyl-4-chlorophényl)-2-aminoacétamide a diminué par rapport à l’échantillon qui n’a pas été évaporé. Aucun pic n’a été détecté pour le N-(2-benzoyl-4-chlorophényl)-2-aminoacétamide ou le nordiazépam dans l’échantillon vide. Ces résultats suggèrent fortement que l’équilibre chimique du nordiazépam et du produit de transformation du nordiazépam, caractérisé par Archontaki et al. s’est déplacé du N-(2-benzoyl-4-chlorophényl)-2-aminoacétamide pour former le nordiazépam pendant l’évaporation des extraits SPE. Aucun pic n’a été détecté qui pourrait être corrélé au produit de dégradation final (C13H10NOCl) du nordiazépam.
Il a été conclu que le nordiazépam était facilement transformé en N-(2-benzoyl-4-chlorophényl)-2-aminoacétamide dans la solution aqueuse acide. Il est intéressant de noter que le nordiazépam a été régénéré pendant le processus d’extraction en phase solide. Ainsi, en utilisant les solutions stockées de nordiazépam à pH 3.0 comme référence dans les calculs des récupérations d’extraction, les récupérations d’extraction sont surestimées. Ces résultats sont importants lors de la validation de la méthode, c’est-à-dire lors de l’évaluation des conditions de stockage, des récupérations d’extraction et des effets de matrice. En outre, la transformation du nordiazépam peut influencer les résultats analytiques globaux si un analogue du nordiazépam marqué aux isotopes n’est pas utilisé comme étalon interne. Il faut également souligner que la transformation du nordiazépam pourrait influencer la précision de la méthode, non seulement pendant le stockage avant l’extraction en phase solide, mais aussi en fonction du pH de la solution utilisée, par exemple lors de la reconstitution des extraits SPE séchés.
Validation de la méthode
La méthode développée a été validée par l’utilisation des analogues marqués aux isotopes, le diazépam-d5 et le nordiazépam-d5 (« Validation de la méthode »), car ces composés n’ont pas été détectés dans les échantillons environnementaux. L’avantage d’utiliser les analogues marqués pour la validation de la méthode est que la méthode peut être validée à l’état de traces dans la matrice réelle dans laquelle les analytes sont quantifiés. Les récupérations relatives d’extraction dans les échantillons d’eaux usées traitées étaient ≥ 87% pour le diazépam-d5 et le nordiazépam-d5 à la concentration élevée et faible (Tableau 3). Les valeurs obtenues sont dans les fourchettes de ce qui peut être attendu lorsque des concentrations de produits pharmaceutiques à l’état de traces sont extraites de matrices complexes . Les récupérations absolues par extraction étaient plus faibles, 63-86%, car les analytes étaient soumis à une suppression d’ions (Tableau 3). À la faible concentration, les effets de matrice (ME %) étaient de 76 ± 14 % et 88 ± 14 % pour le diazépam-d5 et le nordiazépam-d5, respectivement (tableau 3). À la concentration élevée, l’effet de la matrice et les valeurs RSD étaient du même ordre qu’à la concentration faible. Ces chiffres de ME % se situent dans une fourchette acceptable, car les résultats d’autres études montrent que l’effet de matrice obtenu avec les matrices d’eau environnementale peut être relativement élevé. La précision de la méthode a été déterminée par la détermination des récupérations SPE à la faible et à la forte concentration de diazépam-d5 et de nordiazépam-d5 (tableau 3). Les récupérations relatives étaient de 88 ± 7,6 % et 87 ± 12 % pour le diazépam-d5 à la concentration faible et élevée, respectivement, et de 98 ± 7,8 % et 99 ± 6,1 % pour le nordiazépam-d5.
La précision du système chromatographique, exprimée par les valeurs RSD des temps de rétention obtenus pour le diazépam-d5 et le nordiazépam-d5 dans les échantillons d’eaux usées extraits, était ≤ 0,62%. Les valeurs RSD des surfaces de pic pour le diazépam-d5 et le nordiazépam-d5 dans les échantillons d’eaux usées extraites étaient ≤ 7,8 % ( » The liquid chromatography tandem quadrupole mass spectrometry systems « ). En outre, la linéarité, exprimée par le coefficient de corrélation (R2) des courbes d’étalonnage dans les échantillons d’eaux usées traitées, était de 0,988 et 0,957 pour le diazépam et le nordiazépam, respectivement.
Aucun transfert dans le système LC-MS/MS n’a été observé dans cette étude, car aucun pic des analytes ou des composés marqués aux isotopes n’a été détecté dans aucun des échantillons d’eau purifiée Millipore injectés. Rien n’indique qu’une contamination croisée se soit produite pendant la manipulation des échantillons ou l’extraction en phase solide, car les échantillons de tampon phosphate extraits ne contenaient aucun des composés cibles. Le risque d’obtenir des résultats faussement positifs suite à une auto-contamination a donc été considéré comme ayant été minimisé dans cette étude.
La LOQ et la LOD pour le diazépam-d5 et le nordiazépam-d5 ont été déterminées dans des échantillons d’eaux usées traitées. Les limites de quantification ont été fixées à 5,0 pM (1,4 ng L-1) pour le diazépam-d5 et le nordiazépam-d5 où les rapports signal/bruit étaient d’environ 10 et la précision obtenue était de 12,7 et 15,9 RSD % (n = 3) pour les composés respectifs (tableau 3), c’est-à-dire dans la précision stipulée de 20 % . Les valeurs de LOQ obtenues dans la présente étude se situent dans la fourchette de ce qui a été obtenu dans d’autres études pour le diazépam et le nordiazépam dans des échantillons d’eaux usées traitées. Cependant, dans cette étude, un volume de 200 ml d’eau usée traitée a été extrait, en comparaison avec 75 ml dans notre méthode présentée. Les limites de détection étaient de 1,7 pM (0,49 ng L-1) et 2,0 pM (0,55 ng L-1) pour le diazépam-d5 et le nordiazépam-d5, respectivement (tableau 3).
Comme discuté ci-dessus ( » La stabilité du diazépam et du nordiazépam dans les échantillons aqueux acides et neutres « , figure 2), le diazépam et le nordiazépam se sont révélés stables pendant 12 jours à un pH d’échantillon de 7.0 lorsqu’ils sont stockés à température ambiante ou à 4 °C.
Quantification du diazépam et du nordiazépam dans les échantillons d’eau environnementale
La méthode LC-MS/MS développée a été appliquée aux échantillons d’eau environnementale pour la détermination du diazépam et du nordiazépam. Il faut souligner que la méthode développée peut être employée pour les déterminations du diazépam et du nordiazépam dans des échantillons environnementaux dans des conditions acides si des standards internes idéaux sont ajoutés aux échantillons avant le stockage, c’est-à-dire des composés marqués aux isotopes des composés cibles. Dans cette étude, les composés marqués aux isotopes, le diazépam-d5 et le nordiazépam-d5, ont été utilisés comme étalons internes pour compenser la transformation potentielle des composés et d’autres pertes ainsi que les variations au cours de l’analyse.
Des échantillons d’eaux usées et d’eaux de surface traitées ont été analysés pour le diazépam et le nordiazépam. Il n’y avait pas de différences significatives, au niveau de 5 % dans un test t, entre les rapports ioniques obtenus pour les solutions standard (tableau 1) et ceux obtenus pour le diazépam ou le nordiazépam d’origine » naturelle » (P ≥ 0,07). Les concentrations de diazépam et de nordiazépam ont été déterminées à 8,5 (2,4 ng L-1) et 66 pM (18 ng L-1), respectivement. Dans les échantillons prélevés 14 jours plus tard dans la même station de traitement des eaux usées, les concentrations ont été déterminées comme étant de 7,5 (2,1 ng L-1) et 75 pM (20 ng L-1) pour le diazépam et le nordiazépam, respectivement. Ainsi, les concentrations de nordiazépam ont été déterminées comme étant environ un ordre de grandeur plus élevé que celles du diazépam. Ces résultats sont en accord avec les résultats d’autres études sur les effluents d’eaux usées . De plus, dans certains échantillons d’eaux usées traitées, rapportés dans la littérature, le nordiazépam a été quantifié, mais le diazépam n’a pas été détecté. Dans la présente étude, ni le diazépam ni le nordiazépam n’ont été détectés dans les eaux de surface prélevées dans la rivière Fyris, à 3 km en amont de la station d’épuration des eaux usées de Kungsängsverket, ce qui indique peu d’émissions d’eaux usées anthropiques en amont.