H-D-udveksling blev oprindeligt målt af hydrogenudvekslingens fader, Kaj Ulrik Linderstrøm-Lang, ved hjælp af tæthedsgradientrør. I moderne tid er H-D-udveksling primært blevet overvåget ved hjælp af metoderne: NMR-spektroskopi, massespektrometri og neutronkrystallografi. Hver af disse metoder har deres fordele og ulemper.
NMR-spektroskopiRediger
Hydrogen- og deuteriumkerner er groft forskellige i deres magnetiske egenskaber. Derfor er det muligt at skelne mellem dem ved NMR-spektroskopi. Deuteroner vil ikke blive observeret i et 1H NMR-spektrum, og omvendt vil protoner ikke blive observeret i et 2H NMR-spektrum. Når der observeres små signaler i et 1H NMR-spektrum af en stærkt deutereret prøve, kaldes disse for restsignaler. De kan bruges til at beregne deutereringsniveauet i et molekyle. Tilsvarende signaler observeres ikke i 2H NMR-spektre på grund af denne tekniks lave følsomhed sammenlignet med 1H-analysen. Deuteroner udviser typisk meget ens kemiske forskydninger i forhold til deres analoge protoner. Analyse via 13C NMR-spektroskopi er også mulig: de forskellige spinværdier for hydrogen (1/2) og deuterium (1) giver anledning til forskellige splittelsesmultiplikatorer. NMR-spektroskopi kan bruges til at bestemme stedspecifik deuterering af molekyler.
En anden metode anvender HSQC-spektre. Typisk optages HSQC-spektre ved en række tidspunkter, mens hydrogenet udveksles med deuterium. Da HSQC-eksperimentet er specifikt for brint, vil signalet aftage eksponentielt, efterhånden som brinten udveksles. Det er derefter muligt at tilpasse en eksponentiel funktion til dataene og få udvekslingskonstanten. Denne metode giver residusspecifikke oplysninger for alle rester i proteinet samtidigt Den største ulempe er, at den kræver en forudgående tildeling af spektret til det pågældende protein. Dette kan være meget arbejdskrævende, og det begrænser normalt metoden til proteiner, der er mindre end 25 kDa. Da det tager minutter til timer at optage et HSQC-spektrum, skal amider, der udveksles hurtigt, må måles ved hjælp af andre pulssekvenser.
MassespektrometriRediger
Hydrogen-deuteriumudvekslingsmassespektrometri kan bestemme det samlede deuteriumindhold i molekyler, der har gennemgået H/D-udveksling. På grund af den nødvendige prøveforberedelse anses det typisk kun for at give en nøjagtig måling af ikke-udskiftelige hydrogenatomer. Det kan også omfatte H/D-udveksling i gasfasen eller udveksling i opløsningsfasen forud for ionisering. Det har flere fordele i NMR-spektroskopi med hensyn til analyse af H/D-udvekslingsreaktioner: Der er behov for meget mindre materiale, koncentrationen af prøven kan være meget lav (så lav som 0,1 uM), størrelsesgrænsen er meget større, og data kan normalt indsamles og fortolkes meget hurtigere.
Deuteriumkernen er dobbelt så tung som hydrogenkernen, fordi den indeholder både en neutron og en proton. Derfor vil et molekyle, der indeholder en del deuterium, være tungere end et molekyle, der udelukkende indeholder brint. Efterhånden som et protein bliver mere og mere deutereret, øges molekylmassen tilsvarende. Påvisning af ændringen i et proteins masse ved deuterering blev muliggjort af moderne proteinmassespektrometri, som først blev rapporteret i 1991 af Katta og Chait.
Det er mere kompliceret at bestemme stedsspecifik deuterering via massespektrometri end ved hjælp af NMR-spektroskopi. For eksempel kan placeringen og den relative mængde af deuteriumudveksling langs peptidryggen bestemmes groft ved at udsætte proteinet for proteolyse, efter at udvekslingsreaktionen er blevet slukket. De enkelte peptider analyseres derefter for den samlede deuteration af hvert peptidfragment. Ved hjælp af denne teknik bestemmes opløsningen af deuteriumudvekslingen af størrelsen af de peptider, der dannes under fordøjelsen. Pepsin, en sur protease, anvendes almindeligvis til proteolyse, da pH-værdien skal opretholdes under den proteolytiske reaktion. For at minimere tilbagekoblingen skal proteolysen og den efterfølgende massespektrometrianalyse foregå så hurtigt som muligt. HPLC-separation af det peptiske digest udføres ofte ved lav temperatur lige før elektrospray-massespektrometri for at minimere tilbagekobling. På det seneste er UPLC blevet anvendt på grund af dets overlegne separationsmuligheder.
Det blev i 1999 foreslået, at det kunne være muligt at opnå opløsning af enkeltresiduer ved at anvende kollisionsinduceret dissociation (CID) fragmentering af deutererede peptider i forbindelse med tandem-massespektrometri. Det blev hurtigt opdaget, at CID forårsager “scrambling” af deuteriumpositionen i peptiderne. Fragmentering ved MALDI-in-source decay (ISD), elektronindfangningsdissociation (ECD) og elektronoverførselsdissociation (ETD) foregår imidlertid med ringe eller ingen scrambling under de korrekte eksperimentelle betingelser. Forvrængning af isotopmærkningen skyldes kollisionsopvarmning forud for ionens dissociation, og selv om CID forårsager forvrængning, kan kollisionsopvarmning også forekomme under ionisering og iontransport. Ved omhyggelig optimering af de instrumentparametre, der forårsager ionopvarmning, kan hydrogen scrambling imidlertid minimeres i en sådan grad, at isotopmærkningen i opløsningsfasen bevares, indtil der kan foretages fragmentering ved hjælp af en teknik, hvor scrambling ikke forekommer. For nylig er ultraviolet fotodissociation (UVPD) også blevet undersøgt som en mulig fragmenteringsteknik til at lokalisere deuterium i peptider og proteiner. I denne henseende har konklusionerne været blandede, idet det er muligt at opnå UVPD-fragmenter, som ikke har undergået scrambling under visse betingelser, mens andre har vist, at scrambling kan forekomme for både peptider og proteiner under selve UVPD-fragmenteringsprocessen. Den nuværende teori, der konsoliderer disse tilsyneladende modsigelser, har at gøre med den dobbelte fragmenteringsvej, der kan opstå ved UV-bestråling af peptider og proteiner, dvs. direkte og statistisk dissociation. Det vil sige, at hvis de eksperimentelle forhold begunstiger direkte dissociation, og hvis forløberionen holdes ved lave interne energier før og under fragmenteringen, vil deuteriumniveauet i de resulterende fragmenter svare til den ikke-scrambede forløber. De eksperimentelle betingelser kan imidlertid begunstige statistisk dissociation under UV-bestråling, især ved lang bestrålingstid og lavt gastryk, hvilket fører til intern omdannelse af den elektroniske excitationsenergi, som UV-fotonerne bidrager med. Resultatet er en vibrationel excitation af det bestrålede molekyle, som på sin side gennemgår scrambling.
NeutronkrystallografiRediger
Hydrogen-deuterium-udveksling af hurtigt udvekslende arter (f.eks. hydroxylgrupper) kan måles kvantitativt ved atomar opløsning ved hjælp af neutronkrystallografi og i realtid, hvis udvekslingen foregår under diffraktionseksperimentet.
Høje intensitetsneutronstråler genereres generelt ved spallation ved linac-partikelacceleratorer som f.eks. spallationsneutronkilden. Neutroner diffrakterer krystaller på samme måde som røntgenstråler og kan anvendes til strukturbestemmelse. Hydrogenatomer med mellem en og nul elektroner i biologiske omgivelser diffrakterer røntgenstråler dårligt og er faktisk usynlige under normale eksperimentelle forhold. Neutroner spredes fra atomkerner og er derfor i stand til at detektere hydrogen- og deuteriumatomer.
Hydrogenatomer erstattes rutinemæssigt med deuterium, hvilket introducerer en stærk og positiv spredningsfaktor. Det er ofte tilstrækkeligt kun at erstatte opløsningsmidlet og de labile hydrogenatomer i en proteinkrystal ved hjælp af dampdiffusion. I en sådan struktur vil belægningen af et udskifteligt deuteriumatom i en krystal forfines fra 0-100%, hvilket direkte kvantificerer mængden af udveksling.