El intercambio H-D fue medido originalmente por el padre del intercambio de hidrógeno Kaj Ulrik Linderstrøm-Lang utilizando tubos de gradiente de densidad. En los tiempos modernos, el intercambio H-D ha sido monitoreado principalmente por los métodos: Espectroscopia de RMN, espectrometría de masas y cristalografía de neutrones. Cada uno de estos métodos tiene sus ventajas e inconvenientes.
Espectroscopia de RMNEditar
Los núcleos de hidrógeno y deuterio son muy diferentes en sus propiedades magnéticas. Por ello, es posible distinguirlos mediante espectroscopia de RMN. Los deuterones no se observan en un espectro de RMN de 1H y, a la inversa, los protones no se observan en un espectro de RMN de 2H. Cuando se observan pequeñas señales en un espectro de RMN de 1H de una muestra altamente deuterada, éstas se denominan señales residuales. Pueden utilizarse para calcular el nivel de deuteración de una molécula. No se observan señales análogas en los espectros de RMN de 2H debido a la baja sensibilidad de esta técnica en comparación con el análisis de 1H. Los deuterones suelen presentar desplazamientos químicos muy similares a los de sus protones análogos. El análisis mediante espectroscopia de RMN de 13C también es posible: los diferentes valores de espín del hidrógeno (1/2) y del deuterio (1) dan lugar a diferentes multiplicidades de desdoblamiento. La espectroscopia de RMN puede utilizarse para determinar la deuteración específica de las moléculas.
Otro método utiliza los espectros HSQC. Normalmente, los espectros HSQC se registran en una serie de puntos de tiempo mientras el hidrógeno se intercambia con el deuterio. Como el experimento HSQC es específico para el hidrógeno, la señal decaerá exponencialmente a medida que el hidrógeno se intercambie. Entonces es posible ajustar una función exponencial a los datos y obtener la constante de intercambio. Este método proporciona información específica para todos los residuos de la proteína de forma simultánea El mayor inconveniente es que requiere una asignación previa del espectro para la proteína en cuestión. Esto puede ser muy laborioso y suele limitar el método a las proteínas de menos de 25 kDa. Dado que el registro de un espectro HSQC lleva de minutos a horas, las amidas que se intercambian rápidamente deben medirse utilizando otras secuencias de pulsos.
Espectrometría de masasEditar
La espectrometría de masas de intercambio hidrógeno-deuterio puede determinar el contenido global de deuterio de las moléculas que han sufrido un intercambio H/D. Debido a la preparación de la muestra requerida, normalmente se considera que proporciona una medición precisa de los átomos de hidrógeno no intercambiables solamente. También puede implicar el intercambio H/D en la fase gaseosa o el intercambio en fase de solución antes de la ionización. Tiene varias ventajas en la espectroscopia de RMN con respecto al análisis de las reacciones de intercambio H-D: se necesita mucho menos material, la concentración de la muestra puede ser muy baja (tan baja como 0,1 uM), el límite de tamaño es mucho mayor y los datos se pueden recoger e interpretar normalmente con mucha más rapidez.
El núcleo de deuterio es dos veces más pesado que el núcleo de hidrógeno porque contiene un neutrón además de un protón. Por lo tanto, una molécula que contenga algo de deuterio será más pesada que una que contenga todo hidrógeno. Cuando una proteína se deuteriza cada vez más, la masa molecular aumenta en consecuencia. La detección del cambio en la masa de una proteína tras la deuteración fue posible gracias a la moderna espectrometría de masas de proteínas, descrita por primera vez en 1991 por Katta y Chait.
Determinar la deuteración específica del sitio mediante la espectrometría de masas es más complicado que utilizar la espectroscopia de RMN. Por ejemplo, la ubicación y la cantidad relativa de intercambio de deuterio a lo largo de la columna vertebral del péptido pueden determinarse aproximadamente sometiendo la proteína a proteólisis después de que se haya apagado la reacción de intercambio. A continuación, se analizan los péptidos individuales para determinar la deuteración global de cada fragmento peptídico. Mediante esta técnica, la resolución del intercambio de deuterio viene determinada por el tamaño de los péptidos producidos durante la digestión. La pepsina, una proteasa ácida, se utiliza comúnmente para la proteólisis, ya que el pH de enfriamiento debe mantenerse durante la reacción proteolítica. Para minimizar el retroceso, la proteólisis y el posterior análisis por espectrometría de masas deben realizarse lo más rápidamente posible. La separación por HPLC del digerido péptico se realiza a menudo a baja temperatura justo antes de la espectrometría de masas por electrospray para minimizar el retro-intercambio. Más recientemente, se ha utilizado la UPLC debido a su capacidad de separación superior.
En 1999 se propuso que podría ser posible lograr la resolución de un solo residuo utilizando la fragmentación por disociación inducida por colisión (CID) de péptidos deuterados junto con la espectrometría de masas en tándem. Pronto se descubrió que la CID provoca un «desorden» en la posición del deuterio dentro de los péptidos. Sin embargo, la fragmentación producida por la desintegración en la fuente de MALDI (ISD), la disociación por captura de electrones (ECD) y la disociación por transferencia de electrones (ETD) se produce sin o con muy poca mezcla en las condiciones experimentales correctas. El scrambling del etiquetado isotópico es causado por el calentamiento colisional antes de la disociación del ion y mientras la CID causa scrambling, el calentamiento colisional también puede ocurrir durante la ionización y el transporte del ion. Sin embargo, mediante una cuidadosa optimización de los parámetros de los instrumentos que causan el calentamiento de los iones, se puede minimizar el scrambling del hidrógeno hasta un grado que preserve el etiquetado isotópico en fase de solución hasta que se pueda realizar la fragmentación utilizando una técnica en la que no se produzca el scrambling. Más recientemente, también se ha investigado la fotodisociación ultravioleta (UVPD) como posible técnica de fragmentación para localizar el deuterio en péptidos y proteínas. A este respecto, las conclusiones han sido contradictorias, ya que si bien es posible obtener fragmentos de UVPD que no han sufrido scrambling en determinadas condiciones, otros han demostrado que el scrambling puede producirse tanto en los péptidos como en las proteínas durante el propio paso de fragmentación de la UVPD. La teoría actual que consolida estas aparentes contradicciones tiene que ver con la doble vía de fragmentación que puede surgir de la irradiación UV de péptidos y proteínas, es decir, la disociación directa y la estadística. Es decir, si las condiciones experimentales favorecen la disociación directa y el ion precursor se mantiene a bajas energías internas antes y durante la fragmentación, el nivel de deuterio de los fragmentos resultantes corresponderá al precursor no fragmentado. Sin embargo, las condiciones experimentales pueden favorecer la disociación estadística durante la irradiación UV, especialmente con tiempos de irradiación largos y baja presión de gas, lo que lleva a la conversión interna de la energía de excitación electrónica aportada por los fotones UV. El resultado es la excitación vibracional de la molécula irradiada que, a su vez, se somete a revuelta.
Cristalografía de neutronesEditar
El intercambio de hidrógeno-deuterio de especies de intercambio rápido (por ejemplo, grupos hidroxilo) puede medirse a resolución atómica cuantitativamente mediante cristalografía de neutrones, y en tiempo real si el intercambio se lleva a cabo durante el experimento de difracción.
Los haces de neutrones de alta intensidad se generan generalmente por espalación en aceleradores de partículas linac como la Fuente de Neutrones por Espalación. Los neutrones difractan los cristales de forma similar a los rayos X y pueden utilizarse para la determinación estructural. Los átomos de hidrógeno, con entre uno y cero electrones en un entorno biológico, difractan mal los rayos X y son efectivamente invisibles en condiciones experimentales normales. Los neutrones se dispersan desde los núcleos atómicos y, por lo tanto, son capaces de detectar átomos de hidrógeno y deuterio.
Los átomos de hidrógeno se sustituyen rutinariamente por deuterio, lo que introduce un factor de dispersión fuerte y positivo. A menudo es suficiente reemplazar sólo los átomos de hidrógeno solventes y lábiles en un cristal de proteína por difusión de vapor. En tal estructura, la ocupación de un átomo de deuterio intercambiable en un cristal se refinará de 0 a 100%, cuantificando directamente la cantidad de intercambio.