Thiole reagieren mit dieser Verbindung unter Spaltung der Disulfidbindung zu 2-Nitro-5-thiobenzoat (TNB-), das in Wasser bei neutralem und alkalischem pH-Wert zum TNB2-Dianion ionisiert. Dieses TNB2- Ion hat eine gelbe Farbe.
Diese Reaktion ist schnell und stöchiometrisch, wobei die Zugabe von einem Mol Thiol ein Mol TNB freisetzt. TNB2- wird in einem Spektralphotometer durch Messung der Absorption von sichtbarem Licht bei 412 nm quantifiziert, wobei ein Extinktionskoeffizient von 14.150 M-1 cm-1 für verdünnte Pufferlösungen und ein Koeffizient von 13.700 M-1 cm-1 für hohe Salzkonzentrationen, wie 6 M Guanidiniumhydrochlorid oder 8 M Harnstoff, verwendet wird. Leider wurde der Extinktionskoeffizient für verdünnte Lösungen in der Originalveröffentlichung von 1959 mit 13.600 M-1 cm-1 zu niedrig angesetzt, und wie in einem neueren Artikel festgestellt wurde, hat sich dieser Fehler in der Literatur erhalten. Kommerzielles DTNB ist unter Umständen nicht ganz rein, so dass eine Umkristallisierung erforderlich sein kann, um ganz genaue und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten.
Ellmans Reagenz kann zur Messung von Thiolen mit niedriger Molekülmasse wie Glutathion sowohl in reinen Lösungen als auch in biologischen Proben wie Blut verwendet werden. Es kann auch die Anzahl der Thiolgruppen auf Proteinen messen.