Thioler reagerer med denne forbindelse og spalter disulfidbindingen for at give 2-nitro-5-thiobenzoat (TNB-), som ioniseres til TNB2-dianionen i vand ved neutral og alkalisk pH. Denne TNB2-ion har en gul farve.
Denne reaktion er hurtig og stoikiometrisk, idet tilsætning af ét mol thiol frigør ét mol TNB. TNB2- kvantificeres i et spektrofotometer ved måling af absorbansen af synligt lys ved 412 nm med en ekstinktionskoefficient på 14,150 M-1 cm-1 for fortyndede bufferopløsninger og en koefficient på 13,700 M-1 cm-1 for høje saltkoncentrationer, f.eks. 6 M guanidiniumhydrochlorid eller 8 M urinstof. Desværre blev ekstinktionskoefficienten for fortyndede opløsninger undervurderet i den oprindelige publikation fra 1959 som 13.600 M-1 cm-1 , og som det fremgår af en nyere artikel, er denne fejl fortsat gældende i litteraturen. Kommerciel DTNB er muligvis ikke helt ren, så det kan kræve omkrystallisering for at opnå helt nøjagtige og reproducerbare resultater.
Ellmans reagens kan anvendes til måling af thioler med lav molekylær masse som f.eks. glutathion i både rene opløsninger og biologiske prøver som f.eks. blod. Det kan også måle antallet af thiolgrupper på proteiner.