Los tioles reaccionan con este compuesto, escindiendo el enlace disulfuro para dar 2-nitro-5-tiobenzoato (TNB-), que se ioniza al dianión TNB2- en agua a pH neutro y alcalino. Este ion TNB2- tiene un color amarillo.
Esta reacción es rápida y estequiométrica, con la adición de un mol de tiol liberando un mol de TNB. El TNB2- se cuantifica en un espectrofotómetro midiendo la absorbancia de la luz visible a 412 nm, utilizando un coeficiente de extinción de 14.150 M-1 cm-1 para soluciones tampón diluidas, y un coeficiente de 13.700 M-1 cm-1 para altas concentraciones de sal, como clorhidrato de guanidinio 6 M o urea 8 M. Desgraciadamente, el coeficiente de extinción para soluciones diluidas se subestimó en la publicación original de 1959, como 13.600 M-1 cm-1, y como se señala en un artículo reciente, este error ha persistido en la literatura. El DTNB comercial puede no ser completamente puro, por lo que puede requerir una recristalización para obtener resultados completamente precisos y reproducibles.
El reactivo de Ellman puede utilizarse para medir tioles de baja masa molecular, como el glutatión, tanto en soluciones puras como en muestras biológicas, como la sangre. También puede medir el número de grupos tiol en las proteínas.