Tioolit reagoivat tämän yhdisteen kanssa, jolloin disulfidisidos pilkkoutuu ja syntyy 2-nitro-5-tiobentsoaattia (TNB-), joka ionisoituu vedessä neutraalissa ja emäksisessä pH:ssa TNB2- dianioniksi. Tämä TNB2-ioni on väriltään keltainen.
Tämä reaktio on nopea ja stoikiometrinen, ja yhden moolin tioolin lisäys vapauttaa yhden moolin TNB:tä. TNB2- kvantifioidaan spektrofotometrillä mittaamalla näkyvän valon absorbanssi 412 nm:ssä käyttäen ekstinktiokerrointa 14 150 M-1 cm-1 laimeille puskuriliuoksille ja kerrointa 13 700 M-1 cm-1 suurille suolapitoisuuksille, kuten 6 M guanidiniumhydrokloridille tai 8 M urealle. Valitettavasti laimeiden liuosten ekstinktiokerroin aliarvioitiin alkuperäisessä vuoden 1959 julkaisussa 13 600 M-1 cm-1 :ksi, ja kuten eräässä tuoreessa artikkelissa todetaan, tämä virhe on säilynyt kirjallisuudessa. Kaupallinen DTNB ei välttämättä ole täysin puhdasta, joten se saattaa vaatia uudelleenkiteyttämistä täysin tarkkojen ja toistettavien tulosten saamiseksi.
Ellmanin reagenssia voidaan käyttää pienimolekyylimassaisten tiolien, kuten glutationin, mittaamiseen sekä puhtaista liuoksista että biologisista näytteistä, kuten verestä. Sillä voidaan myös mitata proteiinien tioliryhmien määrää.