A tioolok reagálnak ezzel a vegyülettel, és a diszulfidkötést hasítva 2-nitro-5-tiobenzoátot (TNB-) adnak, amely semleges és lúgos pH-n vízben TNB2-dianionná ionizálódik. Ez a TNB2-ion sárga színű.
Ez a reakció gyors és sztöchiometrikus, egy mol tiol hozzáadásával egy mol TNB szabadul fel. A TNB2- mennyiségét spektrofotométeren a látható fény 412 nm-en mért abszorbanciájának mérésével határozzuk meg, híg pufferoldatok esetén 14 150 M-1 cm-1 extinkciós együtthatóval, nagy sókoncentrációk, például 6 M guanidinium-hidroklorid vagy 8 M karbamid esetén pedig 13 700 M-1 cm-1 együtthatóval. Sajnos a híg oldatokra vonatkozó extinkciós együtthatót az eredeti 1959-es publikációban 13 600 M-1 cm-1 -ként alulbecsülték, és amint azt egy nemrégiben megjelent cikk megállapítja, ez a hiba továbbra is fennáll az irodalomban. A kereskedelmi forgalomban kapható DTNB nem feltétlenül teljesen tiszta, így a teljesen pontos és reprodukálható eredmények eléréséhez átkristályosításra lehet szükség.
Az Ellman-reagens használható kis molekulatömegű tiolok, például a glutation mérésére tiszta oldatokban és biológiai mintákban, például vérben egyaránt. A fehérjékben lévő tiolcsoportok számának mérésére is alkalmas.