L’area preottica mediale nei topi è in grado di mediare comportamenti sessualmente dimorfici indipendentemente dal sesso

Animali

C57BL/6J animali sono stati acquistati da Jackson Laboratory, Slac Laboratory Animal (Shanghai) e allevati in casa. Esr1-2a-Cre (Esr1Cre, #017913) e Vglut2-Ires-Cre (Vglut2Cre, #012569) sono stati acquistati dal Jackson Laboratory. Il Vgat-Cre (VgatCre) linea è stato precedentemente generato 68. Tutte le linee Cre sono stati allevati su sfondo C57BL/6J per almeno una generazione. Gli animali sono stati alloggiati nell’Istituto di Neuroscienze struttura animale su 12 h: 12 h ciclo luce / buio con cibo e acqua ad libitum. Solo gli animali eterozigoti di alleli Cre sono stati utilizzati nello studio. Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato per la cura e l’uso degli animali dell’Istituto di Neuroscienze, Accademia Cinese delle Scienze, Shanghai, Cina (IACUC No. NA-016-2016).

Chirurgia

I topi adulti di 2-4 mesi sono stati anestetizzati con isoflurano (0,8-5%) e posti in una struttura stereotassica (David Kopf Instrument, Modello 1900). Unguento oftalmico è stato applicato per prevenire la disidratazione. Il cranio è stato esposto con una piccola incisione e fori sono stati praticati per iniettare il virus con pipette di vetro (15-25 micron di diametro alla punta) e per impiantare fibre ottiche. Le coordinate per la consegna virale nel mPOA erano AP, -0.16 mm; ML, ±0.4 mm; DV, -5.150 mm (Paxios e Franklin mouse cervello atlante, 2 ° edizione). 100-400 nl di virus è stato iniettato per lato ad una velocità di flusso di 70 nl al minuto utilizzando un iniettore fatto in casa nanolitri o a 40 nl al minuto utilizzando una pompa idraulica (Harvard Apparatus). Pipette di vetro sono stati lasciati in posizione per circa ~ 10 min dopo l’iniezione prima di retrazione. Mono fibre ottiche (diametro, 200 micron; N.A., 0,37; lunghezza, 6 mm; AniLab Software and Instruments Co., Ltd) o fibre ottiche doppie (DFC_200/245-0.37_6.0mm_DF0.9_FLT; Doric Lense) sono stati posti 400 micron sopra il sito di iniezione del virus per esperimenti optogenetici o 50 micron sopra per le registrazioni fotometria fibra. Fibre ottiche sono stati fissati con cemento dentale e viti craniche. Littermates sono stati scelti a caso per essere iniettato con il virus sperimentale o di controllo. Interventi di castrazione sono stati eseguiti con gli animali anestetizzati con intraperitoneale (i.p.) iniezione di ketamina (80 mg kg-1) e xilazina (8 mg kg-1). Agli animali sono state concesse 3-4 settimane per recuperare dopo gli interventi chirurgici prima dei successivi test comportamentali.

Virus

Saggi comportamentali

Tutti i test comportamentali sono stati avviati almeno mezz’ora dopo l’inizio del ciclo di buio, e sono stati registrati utilizzando una telecamera a infrarossi ad un frame rate di 25 Hz e valutati da sperimentatori in cieco al genotipo, informazioni sul gruppo, o stato di fotostimolazione degli animali coinvolti. Tutti gli animali testati per i comportamenti, ad eccezione di quelli utilizzati in esperimenti di inibizione optogenetica, erano topi vergini ingenui prima del test. Negli esperimenti di inibizione optogenetica, tutti i topi maschi sono stati co-alloggiati con topi femmina e alcuni di loro sono diventati padri prima del test, mentre alcune femmine sono stati co-alloggiati con cuccioli, o accoppiati per diventare madri, o trattati con settimane di iniezione di testosterone prima del test. Fatta eccezione per gli animali utilizzati in esperimenti di attivazione optogenetica, tutti gli animali sono stati alloggiati singolarmente 3-7 giorni prima dei test comportamentali.

Per i test di comportamento di accoppiamento, una femmina ovariectomizzata primed ormonale C57BL/6 è stata introdotta nella gabbia di casa e videoripresa per 30 min. I test di comportamento di accoppiamento sono stati ripetuti tre volte con diversi animali stimolo almeno tre giorni di distanza. Il comportamento parentale è stato testato spargendo tre cuccioli di età compresa tra P1 e P4 al bordo lontano dal nido e videoregistrando l’animale per ~ 15 min e sono stati ripetuti 2-3 volte. Aggressione territoriale è stato testato introducendo un mouse intruso di Balb / C macchia acquistato da Slac Laboratory Animal (Shanghai) per la gabbia di casa dell’animale testato e videotaping per ~ 15 min.

Video sono stati annotati manualmente su una base frame-by-frame utilizzando un programma MATLAB scritto su misura come precedentemente descritto8. Comportamenti sono stati segnati secondo i seguenti criteri: naso-a-faccia, naso-a-corpo, o naso-aurogenitali contatti avviati dagli animali testati sono segnati collettivamente come “indagine sociale”, di cui naso-aurogenitale contatto è specificamente definito come “chemioinvestigation”, noto anche come “sniff”. La “monta” viene segnata quando l’animale da esperimento mette i suoi arti anteriori sul dorso dello stimolo, sale sopra e muove il bacino. I movimenti pelvici ritmici dopo la monta sono segnati come “spinta pelvica”. Le azioni iniziate dal residente verso un intruso maschio, inclusi affondi, morsi, ruzzoloni, sono segnate come “Attacco”. Il “contatto con il cucciolo” viene valutato quando un animale entra in contatto con un cucciolo con il naso o la bocca. “Pup retrieval” è segnato quando un animale tiene il cucciolo con la bocca e viaggiato, di solito verso il nido. “Accovacciata” è valutato quando l’animale inarca la schiena e si libra sopra i cuccioli nel nido. I cuccioli sono stati sempre ispezionati dopo la prova comportamentale per possibili ferite. Circa il 2% delle prove comportamentali sono risultate in cuccioli feriti. L’esclusione di queste prove non ha influenzato alcuna conclusione.

Attivazione optogenetica

Gli animali utilizzati per gli esperimenti optogenetici erano alloggiati in gruppo. Il giorno del test comportamentale, sono stati introdotti in una gabbia nuova. Una fibra ottica esterna è stata utilizzata per collegare una sorgente di potenza laser 473 nm (Shanghai Laser and Optics Century Co. o Changchun New Industries Optoelectronics Tech Co., Ltd.) alla fibra ottica impiantata nell’animale. La fibra ottica esterna è stata collegata ad un giunto rotante (FRJ_1 × 1_FC_FC, Doric Lense) per consentire all’animale di comportarsi liberamente. L’animale testato è stato permesso di esplorare la gabbia per ~ 15 min con la fibra esterna collegata. Successivamente, un programma MATLAB personalizzato è stato avviato per controllare un Master 9 (A.M.P.I.), che ha inviato un trigger per avviare la registrazione dalla fotocamera e segnali al laser per fornire 15 s di fotostimolazione a 40 Hz 12 mW o 20 Hz 5 mW, distanziati 90-120 s a caso. La potenza del laser è stata regolata per ogni animale in base all’efficienza di transitività della luminanza della fibra ottica impiantata misurata prima dell’impianto per assicurare la potenza della luce emessa sulla punta della fibra. Durante la stimolazione laser, gli animali sono stati testati da soli per la locomozione, o con una femmina ovariectomizzata primed ormonale, un maschio C57BL/6, un giovane ratto di età P13-P15, cuccioli di età P1-P4, o blocchi di gomma di dimensioni simili di cuccioli come lo stimolo. Cinque-dodici stimoli sono stati dati durante ogni test. Uno-quattro saggi con ogni stimolo (3-5 min a parte) sono stati eseguiti in un dato giorno per ogni animale. Dopo il completamento di tutti i test comportamentali, gli animali sono stati dati treni di fotostimolazione (15 s, 12 mW, 40 Hz, 10 volte, un intervallo fisso 105 s) e perfuso transcardialmente con paraformaldeide 4% un’ora dopo la stimolazione luminosa per l’analisi istologica. Il sangue è stato anche raccolto al momento dell’uccisione per le misurazioni ormonali.

Fotometria delle fibre

Gli animali utilizzati per gli esperimenti di fotometria delle fibre sono stati alloggiati singolarmente 3-7 giorni prima dei test comportamentali. Durante il giorno del test, la fibra ottica impiantata è stata collegata a F-scope (Biolink Optics Technology Inc., Pechino), una configurazione integrata di registrazione fotometria fibra, attraverso una fibra ottica esterna. Nel F-scope, un laser di eccitazione 488 nm (OBIS 488LS; Coherent) viene riflesso da uno specchio dicroico (MD498, Thorlabs). I segnali di emissione raccolti attraverso la fibra ottica impiantata sono filtrati con un filtro passabanda (MF525-39, Thorlabs) e diretto su un tubo fotomoltiplicatore (PMT, R3896, Hamamatsu). Durante le registrazioni, la potenza del laser è stata regolata per ogni animale in base all’efficienza transitività luminanza della fibra ottica impiantata per assicurare che la luce emessa sulla punta della fibra era ~ 30 μw e il guadagno di tensione PMT è stato impostato su 500 v per GCamp6s animali e 300-350 v per gli animali di controllo. Una volta avviato, il software F-scope inviato un segnale di trigger per avviare la registrazione video dalla telecamera a infrarossi. Segnali di emissione sono stati filtrati passa-basso a 30 Hz e sono stati campionati a 500 Hz con una scheda di acquisizione dati (USB6009, strumento nazionale) utilizzando un software fornito dal Biolink ottica. Per una data prova, gli animali sono stati prima permesso di esplorare per ~ 5 min, durante il quale sono stati registrati i segnali di base. In seguito, uno stimolo come una femmina ovariectomizzata adescata ormonalmente, un finto giocattolo di plastica per topi, cuccioli di età P1-P4 o blocchi di gomma di dimensioni simili ai cuccioli sono stati introdotti. Gli animali sono stati autorizzati a interagire e il comportamento con gli stimoli per 15-90 min prima della rimozione degli stimoli, dopo di che i segnali sono stati registrati per un altro ~ 5 min.

Inibizione optogenetica

Gli animali utilizzati per gli esperimenti di inibizione optogenetica erano alloggiati singolarmente. I topi maschi sono stati co-housed con le femmine per essere sessualmente esperti o per diventare padri prima del test. Vergine topi femmina sono stati testati come animali ingenui per maschio-tipico accoppiamento e per i comportamenti materni. Nei casi di poveri comportamenti materni di base durante il test iniziale, sono stati co-housed con i cuccioli durante la notte e testato di nuovo per i comportamenti materni. Dopo il test dei comportamenti materni, alcune femmine sono state trattate a giorni alterni con iniezione sottocutanea di testosterone (100 μg in 50 μl di olio di girasole, Shanghai Pharm.) per circa 3 settimane prima di essere testate nuovamente per l’accoppiamento maschio-tipico. Le femmine testate come madri sono state accoppiate dopo l’iniezione virale per produrre i propri cuccioli.

Prima del test comportamentale, un cavo patch a doppia fibra ottica (DFP_200/230/900-0.37_1m_DF0.9_2FCM, Doric Lense) è stato utilizzato per collegare una sorgente di potenza laser 473 nm (Shanghai Laser and Optics Century Co. o Changchun New Industries Optoelectronics Tech Co, Ltd.) alla fibra ottica doppia impiantata (DFC_200/245-0.37_6.0mm_DF0.9_FLT, Doric Lense) nell’animale attraverso un giunto rotante (FRJ 1 × 2i FC-2FC 0.22, Doric Lense) per consentire all’animale di comportarsi liberamente. Dopo ~ 10 min di abitazione, la telecamera è stata attivata per registrare il processo comportamentale da un segnale inviato da Master 9, che è stato controllato da un programma MATLAB scritto su misura. Per consegnare la luce dopo l’avvicinamento, la luce (~12 mW) è stato automaticamente attivato per essere continuamente consegnato fino a quando le posizioni dell’animale testato sono stati rilevati dal programma per essere all’interno di una lunghezza del corpo alla femmina ovariectomizzato ormonale innescato in test di comportamento di accoppiamento o all’interno della regione cucciolo, che è stato definito dalla marcatura di una zona leggermente più grande che circonda ogni cucciolo sparso in test di comportamento materno. Almeno due prove di luce e due prove senza luce sono state eseguite alternativamente per ogni test. Per fornire luci dopo l’avvio di comportamenti definiti, luce blu (~ 12 mW) di lunghezza fissa (5 o 10 s) è stato attivato manualmente quando lo sperimentatore osservato il comportamento di interessi in tempo reale. Una o due prove di luce sono state eseguite alternativamente per ogni test.

Immunostaining fluorescente

Gli animali sono stati anestetizzati con cloralio idrato al 10% e perfusi transcardialmente con PBS seguito da paraformaldeide (PFA) al 4% in PBS. Successivamente, i cervelli sono stati sezionati a 40 micron di spessore utilizzando un vibratome (VT1000S, Leica). Sezioni sono stati divisi equamente in diversi set e trattati per la colorazione o montato direttamente. Sezioni cerebrali sono stati bloccati in 5% di siero di capra in AT (0,1% Triton e 2 mM MgCl2 in PBS) per 1 h a temperatura ambiente e incubato una notte a 4 ° C in AGT (0,5% siero di capra normale, 0.1% Triton e 2 mM MgCl2 in PBS) contenente appropriato anticorpo primario (coniglio anti-c-Fos, 1:2000, Santa Cruz, Cat# sc-52; coniglio anti-Esr154, 1:10,000, Millipore, Cat# 06-935). Il giorno successivo, le sezioni del cervello sono state lavate con AGT per tre volte (30 min ciascuna) e incubate con anticorpi secondari appropriati (Alexa Fluor 488 coniugato, 1:1000; Cy3 coniugato, 1:1000, Jackson ImmunoResearch) a temperatura ambiente per 2 ore. Le sezioni del cervello sono state controcolorate con Neuro Trace (Life Technologies, Cat# N21479, 1:300) o DAPI (5 mg ml-1, 1:1000, Sigma) in AT. Dopo diversi lavaggi in AGT, AT e PBS, le sezioni del cervello sono state montate su vetrini di vetro.

Macchiatura DAB

Le sezioni del cervello sono state preparate in modo simile agli esperimenti di immunostaining fluorescente e sono state pretrattate con il 3% di H2O2 per 30 minuti a temperatura ambiente per bloccare la perossidasi endogena, lavate due volte per 10 minuti ciascuna in PBST (0.3% Triton X-100 in PBS), bloccate con 5% di siero di capra in PBST per 2 ore a temperatura ambiente, e incubate con l’anticorpo primario anti-c-Fos (Rabbit anti-c-fos, 1:2000, Santa Cruz, Cat# sc-52) in PBST per una notte a 4 °C. Il giorno successivo, le sezioni sono state lavate sei volte in PBST, 10 min ciascuna, e poi incubate con l’anticorpo secondario di capra anti-rabbit coniugato con biotina (Cat #111-065-003, Jackson ImmunoResearch) in PBST per 2 ore a temperatura ambiente. Dopo tre lavaggi in PBS, 5 min ciascuno, le sezioni del cervello sono stati colorati con VECTASTAIN ® Reagente ABC per 30 min seguendo il manuale del produttore. Dopo due lavaggi di 5 minuti in PBS, le sezioni cerebrali sono state incubate in soluzione di 3,3-diaminobenzidina (Cat# D5637-5G, Sigma) con intensificazione di nichel fino a raggiungere l’intensità di colorazione desiderata. La reazione è stata fermata sciacquando le sezioni in acqua di rubinetto. Le sezioni del cervello sono state montate su vetrini e catturate sotto obiettivi ×4 o ×10 con microscopi a luce convenzionale.

Ibridizzazione in situ

I modelli di DNA per la generazione di sonde in situ sono stati clonati utilizzando i seguenti set di primer per ogni gene corrispondente: Vgat, 5′-gccattcagggcatgttc-3′ e 5′-agcagcgtgaagacc-3′; Vglut2, 5′-atcgactagtccaaatcttacggtgctacctc-3′ e 5′-atcgctcgagtagccatctttcctgttccact-3′; Cre, 5′- ccaatttactgaccgtacacca-3′ e 5′-tatttacattggtccagccacc-3′; GAD1, 5′-cattgaggagatagaggttg-3′ e 5′-agagaagcgaaggctact-3′; Galanin, 5′-atcctgcactgaccagcc-3′ e 5′-ttggcttgaggagttggc-3′. Anti-senso sonde RNA sono stati trascritti con T7 RNA polimerasi (Promega, Cat # P207E) e digossigenina (DIG) – nucleotidi etichettati. Gli animali sono stati anestetizzati con cloralio idrato al 10% e perfusi transcardialmente con PBS trattato con DEPC (D-PBS) seguito da paraformaldeide fredda al 4% (PFA) in D-PBS. Successivamente, i cervelli sono stati sezionati a 40 micron di spessore utilizzando un vibratome (VT1000S, Leica). Sezioni cerebrali sono stati lavati in 2XSSC buffer contenente 0,1% triton per 30 min, acetilato in trietanolamina 0,1 M (pH 8,0) con 0,25% anidride acetica (vol / vol) per 10 min, equilibrato in soluzione pre-ibridazione per 2 ore a 65 ℃ e successivamente incubato con 0,5 μg ml-1 di sonde RNA specifiche in tampone di ibridazione durante la notte a 65 ℃. Il giorno successivo, le sezioni sono state risciacquate in soluzione pre-ibridazione e pre-hyb/TBST (TBS con 0,1% tween-20) per 30 min ciascuno. Successivamente, le sezioni sono state lavate con TBST per due volte e TAE per tre volte, ciascuna per 5 min. Le sezioni sono state poi trasferite in pozzetti di gel di agarosio al 2%, che sono stati eseguiti in 1XTAE a 60 V per 2 ore per rimuovere le sonde non ibridizzate. Le sezioni sono state poi lavate due volte in TBST, e successivamente incubate con pecora anti-digossigenina-AP (1:2000, Roche, Cat# 11093274910), a volte insieme con l’anticorpo di coniglio anti-Esr1 (1:3000, Millipore, Cat# 06-935) per scopi di co-colorazione, in 0,5% di reagente bloccante (Roche, 11096176001) a 4 °C durante la notte. Il secondo giorno, per la colorazione in campo chiaro le sezioni sono state lavate e colorate con NBT (Roche, Cat# 11383213001) e BCIP (Roche, Cat# 11383221001) per 4-10 ore a 37 ℃. Per l’ibridazione fluorescente in situ combinata con l’immunoistochimica, le sezioni sono state colorate prima con anticorpi secondari fluorescenti, seguiti dalla colorazione con rosso veloce (HNPP Fluorescent Detection Set, Roche, Cat# 11758888001) e dalla controcolorazione con DAPI (5 mg ml-1, 1:1000, Sigma) in PBS. Tutte le sezioni sono state lavate dopo la colorazione e montate su vetrini. Le immagini sono state catturate con obiettivo ×20 usando un microscopio convenzionale o confocale.

catFISH

La maggior parte degli animali usati nell’esperimento catFish erano esperti. Per la procedura, agli animali sono stati concessi due episodi di 5 minuti di interazioni sociali con una femmina ovariectomizzata adescata ormonalmente o con cuccioli sparsi, a distanza di 30 minuti. Subito dopo il secondo episodio, gli animali sono stati anestetizzati con cloralio idrato 10% e perfuso transcardialmente con DEPC-PBS seguita da ghiaccio 4% PFA in PBS. Cervelli sono stati sezionati e post-fisso durante la notte a 4 ° C e disidratato con saccarosio 30% in DPEC-PBS. Successivamente, i cervelli sono stati sezionati a 20 micron di spessore e montati su SuperFrost Plus ® Slides (Fisher Scientific, Cat. No. 12-550-15). Dopo l’essiccazione all’aria, i vetrini sono stati conservati in -80 ° C prima di essere trattati secondo RNAscope ® Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 Manuale Utente (ACD Bio.). Sonde contro c-Fos introne, c-Fos mRNA, e Esr1 sono stati ordinati da ACD Bio. e utilizzati nell’esperimento. Le immagini sono state catturate sotto un obiettivo ×60 utilizzando un microscopio confocale.

Registrazioni elettrofisiologiche

Gli animali C57BL/6 iniettati con AAVs che codificano ChR2-mCherry nella mPOA o i topi Esr1Cre iniettati con AAVs che codificano GtACR1 sono stati anestetizzati con isoflurano e perfusi transcardialmente con soluzione ossigenata fredda come il ghiaccio (95% O2/5% CO2) ad alto contenuto di saccarosio (composizione in mM: 2..5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 2 Na2HPO4, 2 MgSO4, 213 saccarosio, 26 NaHCO3). Dopo la dissezione del cervello, sezioni coronali tra cui il mPOA sono stati tagliati a 250 micron utilizzando un vibratome (VT-1200S, Leica) in ghiaccio soluzione ossigenata taglio. Fette di cervello sono stati poi incubati in liquido cerebrospinale artificiale (ACSF; composizione in mM: 126 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1.25 Na2HPO4, 2 MgSO4, 10 glucosio, 26 NaHCO3, 2 CaCl2) a 34 ° C per almeno 1 h e registrato a temperatura ambiente. Le cellule sono state identificate al microscopio a fluorescenza e visualizzate dal contrasto di interferenza differenziale a infrarossi (BX51, Olympus). Whole-cell current clamp registrazioni sono state effettuate con un amplificatore MultiClamp700B e Digidata 1440A interfaccia (Molecular Devices). Il patch-clamp elettrodo (5-8 MΩ) è stato riempito con una soluzione intracellulare (composizione in mM: 120 K-gluconato, 4 KCl, 10 HEPES, 10 fosfocritina di sodio, 4 Mg-ATP, e 0,3 Na3-GTP, pH: 7.3, 265 mOsm). Per l’attivazione optogenetica, la luce blu (473 nm, 10 ms larghezza, 14 mw mm-2, 40 impulsi) è stato consegnato su fette attraverso ×40 obiettivo utilizzando un X-Cite LED sorgente luminosa (Lumen Dynamics). La fedeltà spike in ChR2-espressione neuroni è stata misurata contando il numero di impulsi di luce che ha evocato con successo potenziali d’azione a diverse frequenze. Fedeltà Spike è stata mediata attraverso cinque stimolazioni e tracciata. Per l’inibizione optogenetica, il potenziale d’azione dei neuroni che esprimono GtACR1 è stato indotto trattenendo il potenziale di membrana -48 mW con un’iniezione di corrente e la luce blu continua ripetuta è stata consegnata sulle fette.

Immagine del calcio in fette di cervello

AAV che codificano ChR2 e AAV che codificano GCamp6s, entrambi guidati da hSyn, sono stati coiniettati nel mPOA di animali C57BL/6. Fette di cervello acuto tra cui il mPOA sono stati preparati simili alle procedure elettrofisiologiche descritte sopra. Calcium imaging è stato effettuato utilizzando due fotoni laser-scansione microscopio (Ultima, Prairie Instruments Inc.) con un 20X/0.95-NA XLUMPLFL acqua-immersione obiettivo (Olympus). Il laser Ti:zaffiro è stato sintonizzato a 940 nm, e le immagini di dimensioni di 512 × 512 pixel sono stati acquisiti attraverso 525/70 nm filtro di emissione a 1,2 Hz frame rate. Treni randomizzati di luce 470 nm (impulso 10-ms, 15 s, 8.4 mW mm-2) di diverse frequenze (10 Hz, 20 Hz, 40 Hz) sono stati consegnati alle fette con intervalli di ~ 2 min. Le immagini sono state analizzate utilizzando ImageJ.

Saggi ormonali

Il sangue del tronco è stato raccolto al momento dell’uccisione prima della perfusione. Il siero è stato preparato. I titoli ormonali sono stati valutati utilizzando un kit ELISA per il testosterone (DRG Instruments GmbH, Germania, Divisione di ARG international, Inc, Cat# EIA-1559) secondo i protocolli del produttore.

Analisi dei dati

Tutti i codici sono stati scritti in MATLAB e utilizzati per l’analisi dei dati, e sono disponibili su richiesta. Non è stato eseguito alcun calcolo della dimensione del campione. Il numero di cellule registrate in fetta o contate in colorazione e il numero di animali utilizzati per i test comportamentali e colorazione sono stati scelti in base alla letteratura pubblicata di esperimenti simili. I punti di dati da animali che su analisi istologica post hoc sono stati considerati come errori secondo i criteri prestabiliti sono stati esclusi dall’analisi. In tutto, tre topi Esr1Cre femmina e un topo Esr1Cre maschio iniettato con GtACR1, un maschio e femmina VgatCre e un topo Esr1Cre femmina iniettato con Casp3 sono stati esclusi dall’analisi.

Per analizzare i dati dagli esperimenti di imaging Ca2+ in fette di cervello, le immagini sono state quantificate in ImageJ. Brevemente, le cellule GCaMP6s+ sono state delineate manualmente e le variazioni di fluorescenza relativa (ΔF/F) sono state calcolate per ogni cella con l’equazione ΔF/F = (F-F0)/F0, in cui F0 è l’intensità media dei pixel negli ultimi 10 fotogrammi prima della fotostimolazione e F è l’intensità media dei pixel nei primi 6 fotogrammi dopo la fotostimolazione. Le immagini acquisite durante i periodi di fotostimolazione sono state escluse dall’analisi. Una cella attivata è stata operativamente definita come cellule che mostrano un aumento di ΔF/F che era 5 deviazioni standard lontano dai valori medi di ΔF/F misurati in 30 fotogrammi prima della prima fotostimolazione.

Per analizzare la locomozione evocata dalla luce, le tracce di movimento sono state prima estratte usando codici MATLAB personalizzati, che riconoscono il centroide di un animale. La velocità di movimento è stata poi calcolata in intervalli di tempo di 1 s misurando la distanza percorsa. I 15 punti di dati sulla velocità di movimento durante un periodo di fotostimolazione sono stati confrontati con i precedenti 15 punti per verificare se quella stimolazione luminosa ha indotto un aumento della velocità in quel processo. A livello di animale, le medie delle velocità di movimento durante ogni periodo di fotostimolazione sono state confrontate con le medie delle velocità di movimento immediatamente prima di ogni periodo di fotostimolazione per determinare se la luce indotta dalla locomozione aumenta in quell’animale. Per il montaggio indotto dalla luce e il recupero dei cuccioli, i video sono stati prima valutati alla cieca. I registri video sono stati poi allineati ai registri di fotostimolazione per estrarre la percentuale di prova, la latenza di inizio e la durata totale dei comportamenti evocati. Solo i comportamenti che si sono verificati durante la stimolazione della luce sono stati contati come comportamenti indotti optogeneticamente. Se un comportamento si è verificato prima di ma tuttavia corse in un periodo di fotostimolazione, tale comportamento non è stato contato come comportamenti indotti optogeneticamente. I parametri sono sempre stati mediati tra i periodi di fotostimolazione nello stesso processo comportamentale e poi tra le prove se ci sono stati più. Per tracciare la distribuzione temporale dei comportamenti evocati optogeneticamente, solo i periodi di fotostimolazione in cui i comportamenti si sono verificati sono stati utilizzati per la media. Nelle prove comportamentali con un maschio, un giovane ratto o cuccioli falsi sono stati utilizzati come stimolo o quando gli animali ChR2 sono stati castrati, comportamenti optogeneticamente indotti sono stati confrontati con comportamenti spontanei che si sono verificati nel periodo di 15 s immediatamente precedente periodi di fotostimolazione.

Per analizzare l’effetto di inibizione optogeneticamente sul comportamento specifico, i video sono stati prima segnato in cieco. I registri video sono stati poi allineati ai registri di fotostimolazione per estrarre gli eventi di comportamento che hanno incontrato la stimolazione della luce. Per tracciare vari parametri di comportamenti specifici, gli eventi comportamentali incontrati stimolo luce sono stati mediati a livello di prova se più prove esistevano e poi a livello di animale. Per tracciare la distribuzione di accumulo di comportamenti specifici, solo gli eventi di comportamento che hanno incontrato la stimolazione della luce sono stati analizzati.

Per simulare un centro di attivazione per un animale ChR2, una zona 1100 × 1500 micron con un lato vicino alla linea mediana e il lato perpendicolare vicino al fondo del cervello è stato ritagliato da ogni sezione coronale del cervello ed è stato ridimensionato a 1 μm per pixel. I segnali c-Fos in ogni 100×100 μm sono stati estratti in modo semi-automatico utilizzando il programma MATLAB insieme a ImageJ e sommati in una matrice 11 × 15 secondo le loro posizioni all’interno di ogni sezione. Il numero medio di cellule NeuN/HuCD + all’interno di un quadrato 100 μm2 è stato stimato essere ~ 25. Per calcolare le coordinate del centro di attivazione lungo l’asse laterale-mediale e dorsale-ventrale, i numeri all’interno della matrice 11 × 15 sono stati mediati attraverso una serie di sezioni del cervello che si estendeva anteriormente e posteriormente per ogni animale e montato con due dimensioni funzione gaussiana in MATLAB. Per calcolare la coordinata anteriore-posteriore del centro di attivazione, il numero totale di c-Fos è stato sommato per ogni sezione del cervello e montato con una singola funzione gaussiana.

Per gli esperimenti di fotometria fibra, segnali di fluorescenza grezzi sono stati ulteriormente regolati secondo la tendenza generale per tenere conto di sbiancamento foto. Gli esperimenti con jitter, onde quadrate di segnali o con un rapporto segnale/rumore estremamente basso sono stati esclusi da ulteriori analisi. Per la risposta iniziale, i valori di cambiamento di fluorescenza (ΔF/F) è stato derivato calcolando (F-F0)/F0, dove F0 è la mediana del segnale di fluorescenza di base. Per i segnali di fluorescenza allineati ai comportamenti, i dati sono stati segmentati in base agli eventi comportamentali all’interno delle singole prove e i segnali medi 10-15 s prima dell’inizio del comportamento sono stati utilizzati come F0. Per analizzare la significatività statistica dei due segnali di fluorescenza evento-correlati, t test con false discovery rate (FDR) di 0.05 è stato utilizzato. Per correlare Ca2 + transienti e comportamenti, una rampa Ca2 + evento è stato contato quando i valori ΔF / F erano 3 deviazione standard sopra la linea di base e durò per più di 2 s. Il numero di eventi Ca2 + sono stati contati tra il primo e l’ultimo comportamento e correlato con il numero di eventi comportamentali durante quel periodo. Solo le prove comportamentali che avevano più di due montaggi e più di un recupero sono stati utilizzati per l’analisi di correlazione.

Le immagini istologiche sono state catturate con obiettivo ×20 su un microscopio confocale se non diversamente specificato. Le immagini sono state elaborate e contate in ImageJ con codici MATLAB scritti su misura. Tutto il conteggio è stato fatto da sperimentatori ciechi al sesso o la condizione di prova dell’animale. Per analizzare l’espressione virale di ChR2, la co-etichettatura di ChR2, c-Fos e Nissl nella zona di iniezione centro è stato contato manualmente. Per analizzare co-etichettatura di Esr1 e Vglut2, Vgat o Galanin, cinque aree relativamente fisso in cinque sezioni del cervello di posizioni simili sono stati selezionati per contare manualmente. Per testare la specificità di espressione Cre in Esr1-cre animali, la co-etichettatura di Esr1 e Cre è stato contato manualmente in varie aree di fette multiple ottenute da un animale. Per quantificare le immagini degli esperimenti catFISH, che sono state prese sotto un obiettivo ×60, le cellule positive per c-Fos citoplasmatico o nucleare e per Esr1 sono stati riconosciuti con DAPI come controcolorazione e contati manualmente. Per quantificare gli effetti dell’ablazione virale dei neuroni Esr1 +, Esr1 + segnali nel mPOA come definito dal Brain Atlas Allen sono stati contati per entrambi i lati utilizzando stereologia unbiased con Stereo Investigator software (MBF bBioscience). In particolare, utilizzando un frazionatore ottico sonda, Esr1 + segnali sono stati enumerati in una scatola di conteggio 30 × 30 micron all’interno di una griglia di campionamento 100 × 100 micron. Per quantificare gli effetti dell’ablazione virale di Vgat + o Vglut2 + neuroni, sezioni di cervello sono stati ripresi con obiettivo ×10 tramite Olympus VS120. Aree che macchiato con Vgat + o Vglut2 + segnali all’interno del mPOA e regioni adiacenti sono stati estratti semi-automatico utilizzando codici MATLAB.

Statistica

Per i grafici a barre, i dati sono presentati come media ± s.e.m. In box and whiskers plots, i dati sono presentati come baffi min a max e la media indicata da “+” e la mediana indicata da una linea orizzontale. Se non diversamente specificato, sono stati eseguiti i seguenti test statistici e tutti i test sono stati specificati come a due facce. I dati categorici sono stati analizzati con il test esatto di Fisher. I dati appaiati sono stati analizzati con il test di coppia. Per analizzare la differenza statistica della distribuzione di accumulazione, è stato utilizzato il test Kolmogorov-Smirnov a due campioni. I dati con una variabile indipendente sono stati analizzati mediante ANOVA a una via seguita da test post hoc con correzione di Bonferroni. I dati con due variabili indipendenti sono stati analizzati da ANOVA a due vie seguite da test post hoc con correzione di Bonferroni. Per altri confronti, i dati sono stati testati per la distribuzione con il test di normalità di Lilliefors. Se i dati hanno superato il test di normalità, è stato utilizzato il test parametrico (test t di Student). Altrimenti, è stato utilizzato il test non parametrico di Wilcoxon rank sum. Il valore p e il coefficiente di correlazione per la correlazione di Pearson sono stati calcolati utilizzando una distribuzione t di Student per una trasformazione della correlazione. *p < 0,05, **p ≤ 0,01, ***p < 0,001.

Disponibilità dei dati

Tutti i dati di questo studio sono disponibili su richiesta.