Tiere
C57BL/6J-Tiere wurden vom Jackson Laboratory, Slac Laboratory Animal (Shanghai) erworben und im Haus gezüchtet. Esr1-2a-Cre (Esr1Cre, #017913) und Vglut2-Ires-Cre (Vglut2Cre, #012569) wurden vom Jackson Laboratory erworben. Die Vgat-Cre-Linie (VgatCre) wurde zuvor erzeugt68. Alle Cre-Linien wurden für mindestens eine Generation auf den C57BL/6J-Hintergrund gezüchtet. Die Tiere wurden in der Tieranlage des Institute of Neuroscience bei einem 12 h:12 h Licht/Dunkel-Zyklus mit Futter und Wasser ad libitum untergebracht. Für die Studie wurden nur heterozygote Tiere mit Cre-Allelen verwendet. Alle Versuchsprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee des Institute of Neuroscience, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China (IACUC No. NA-016-2016) genehmigt.
Operation
Erwachsene Mäuse im Alter von 2-4 Monaten wurden mit Isofluran (0,8-5%) betäubt und in einen stereotaktischen Rahmen (David Kopf Instrument, Modell 1900) gesetzt. Eine Augensalbe wurde aufgetragen, um eine Austrocknung zu verhindern. Der Schädel wurde durch einen kleinen Schnitt freigelegt, und es wurden Löcher gebohrt, um das Virus mit Glaspipetten (15-25 μm Durchmesser an der Spitze) zu injizieren und um optische Fasern zu implantieren. Die Koordinaten für die Viruseinbringung in das mPOA waren AP, -0,16 mm; ML, ±0,4 mm; DV, -5,150 mm (Paxios und Franklin Mausgehirnatlas, 2. Auflage). 100-400 nl Virus wurden pro Seite mit einer Flussrate von 70 nl pro Minute mit einem selbstgebauten Nanoliter-Injektor oder mit 40 nl pro Minute mit einer Hydraulikpumpe (Harvard Apparatus) injiziert. Die Glaspipetten wurden nach der Injektion für ca. 10 Minuten in der Probe belassen, bevor sie zurückgezogen wurden. Monooptische Fasern (Durchmesser, 200 μm; N.A., 0.37; Länge, 6 mm; AniLab Software and Instruments Co., Ltd) oder duale optische Fasern (DFC_200/245-0.37_6.0mm_DF0.9_FLT; Doric Lense) wurden 400 μm über der Virusinjektionsstelle für optogenetische Experimente oder 50 μm darüber für faserphotometrische Aufzeichnungen angebracht. Die Lichtleitfasern wurden mit Zahnzement und Schädelschrauben befestigt. Die Wurfgeschwister wurden nach dem Zufallsprinzip ausgewählt, um entweder das Versuchs- oder das Kontrollvirus zu injizieren. Bei der Kastration wurden die Tiere mit einer intraperitonealen (i.p.) Injektion von Ketamin (80 mg kg-1) und Xylazin (8 mg kg-1) betäubt. Die Tiere konnten sich nach den Operationen 3-4 Wochen lang erholen, bevor die folgenden Verhaltenstests durchgeführt wurden.
Virus
Verhaltenstests
Alle Verhaltenstests wurden mindestens eine halbe Stunde nach Beginn des Dunkelheitszyklus eingeleitet und mit einer Infrarotkamera bei einer Bildfrequenz von 25 Hz aufgezeichnet und von Versuchsleitern ausgewertet, die gegenüber dem Genotyp, der Gruppeninformation oder dem Photostimulationsstatus der beteiligten Tiere verblindet waren. Alle Tiere, deren Verhalten getestet wurde, mit Ausnahme derjenigen, die in optogenetischen Hemmexperimenten verwendet wurden, waren vor dem Test naive, jungfräuliche Mäuse. Bei den Experimenten zur optogenetischen Hemmung wurden alle männlichen Mäuse gemeinsam mit weiblichen Mäusen untergebracht, und einige von ihnen wurden vor dem Test zu Vätern, während einige weibliche Tiere gemeinsam mit Welpen untergebracht wurden oder sich paarten, um Mütter zu werden, oder vor dem Test mit einer wochenlangen Testosteroninjektion behandelt wurden. Mit Ausnahme der Tiere, die in optogenetischen Aktivierungsexperimenten verwendet wurden, waren alle Tiere 3-7 Tage vor den Verhaltenstests einzeln untergebracht.
Für die Paarungsverhaltenstests wurde ein hormonell geprimtes ovarektomiertes C57BL/6-Weibchen in den Heimkäfig gebracht und 30 Minuten lang videografiert. Die Tests zum Paarungsverhalten wurden dreimal mit unterschiedlichen Stimulanzien im Abstand von mindestens drei Tagen wiederholt. Das elterliche Verhalten wurde getestet, indem drei Jungtiere im Alter zwischen P1 und P4 am Rande des Nestes verstreut wurden und das Tier ca. 15 Minuten lang videografiert wurde. Territoriale Aggression wurde getestet, indem eine Balb/c-Maus, die von Slac Laboratory Animal (Shanghai) erworben wurde, in den Heimkäfig des getesteten Tieres eingeführt und ~15 Minuten lang gefilmt wurde.
Die Videos wurden manuell Bild für Bild mit Hilfe eines speziell geschriebenen MATLAB-Programms kommentiert, wie zuvor beschrieben8. Die Verhaltensweisen wurden nach folgenden Kriterien bewertet: Nase-zu-Gesicht-, Nase-zu-Körper- oder Nase-zu-Urogenital-Kontakte, die von den Versuchstieren initiiert wurden, werden zusammen als „soziale Untersuchung“ bewertet, wobei der Nase-zu-Urogenital-Kontakt speziell als „Chemoinvestigation“, auch bekannt als „Schnüffeln“, definiert ist. Das „Aufsteigen“ wird gewertet, wenn das Versuchstier seine Vorderbeine auf den Rücken des Stimulus setzt, auf diesen klettert und das Becken bewegt. Rhythmische Beckenbewegungen nach dem Aufsteigen werden als „Beckenstoß“ bewertet. Handlungen, die der Bewohner gegenüber einem männlichen Eindringling ausführt, wie z. B. Ausfallschritte, Bisse oder Taumeln, werden als „Angriff“ gewertet. „Welpenkontakt“ wird bewertet, wenn ein Tier einen Welpen mit seiner Nase oder seinem Maul berührt. Das „Apportieren von Jungtieren“ wird gewertet, wenn ein Tier ein Jungtier mit dem Maul festhält und es in der Regel in Richtung des Nestes transportiert. „Hocken“ wird gewertet, wenn das Tier seinen Rücken krümmt und über den Welpen im Nest schwebt. Die Jungtiere wurden nach den Verhaltensversuchen immer auf mögliche Wunden untersucht. Etwa 2 % der Verhaltensversuche führten zu verletzten Jungtieren. Der Ausschluss dieser Versuche hatte keinen Einfluss auf die Schlussfolgerungen.
Optogenetische Aktivierung
Die Tiere für die optogenetischen Experimente wurden in Gruppen untergebracht. Am Tag des Verhaltenstests wurden sie in einen neuen Käfig gebracht. Eine externe optische Faser wurde verwendet, um eine 473-nm-Laser-Energiequelle (Shanghai Laser and Optics Century Co. oder Changchun New Industries Optoelectronics Tech Co., Ltd.) an die implantierte optische Faser im Tier anzuschließen. Die externe optische Faser wurde an einem Drehgelenk (FRJ_1 × 1_FC_FC, Doric Lense) befestigt, damit sich das Tier frei bewegen konnte. Das getestete Tier durfte den Käfig ~15 Minuten lang mit der angebrachten externen Faser erkunden. Danach wurde ein benutzerdefiniertes MATLAB-Programm gestartet, um einen Master 9 (A.M.P.I.) zu steuern, der einen Auslöser zum Starten der Aufzeichnung von der Kamera und Signale an den Laser sendete, um 15 s Photostimulation mit 40 Hz 12 mW oder 20 Hz 5 mW in zufälligen Abständen von 90-120 s zu liefern. Die Laserleistung wurde für jedes Tier entsprechend der vor der Implantation gemessenen Luminanztransmissionseffizienz der implantierten Glasfaser eingestellt, um die Leistung des an der Spitze der Faser emittierten Lichts zu gewährleisten. Während der Laserstimulation wurden die Tiere entweder allein auf ihre Fortbewegung getestet oder zusammen mit einem hormonell stimulierten ovarektomierten Weibchen, einem C57BL/6-Männchen, einer jungen Ratte im Alter von P13-P15, Welpen im Alter von P1-P4 oder Gummiblöcken von ähnlicher Größe wie die Welpen als Stimulus. Bei jedem Versuch wurden fünf bis zwölf Stimuli verabreicht. An jedem Tag wurden für jedes Tier ein bis vier Versuche mit jedem Stimulus (im Abstand von 3-5 Minuten) durchgeführt. Nach Abschluss aller Verhaltenstests wurden die Tiere mit Lichtstimulationen (15 s, 12 mW, 40 Hz, 10-mal, festes Intervall von 105 s) behandelt und eine Stunde nach der Lichtstimulation für die histologische Analyse transkardial mit 4% Paraformaldehyd perfundiert. Außerdem wurde zum Zeitpunkt der Tötung Blut für Hormonmessungen entnommen.
Faserphotometrie
Die Tiere, die für die Experimente zur Faserphotometrie verwendet wurden, wurden 3-7 Tage vor den Verhaltenstests einzeln untergebracht. Am Tag der Prüfung wurde die implantierte optische Faser über eine externe optische Faser mit dem F-Scope (Biolink Optics Technology Inc., Peking), einem integrierten Aufzeichnungssystem für die Faserphotometrie, verbunden. Im F-Scope wird ein 488-nm-Anregungslaser (OBIS 488LS; Coherent) von einem dichroitischen Spiegel (MD498, Thorlabs) reflektiert. Die durch die implantierte optische Faser gesammelten Emissionssignale werden mit einem Bandpassfilter (MF525-39, Thorlabs) gefiltert und auf eine Photomultiplier-Röhre (PMT, R3896, Hamamatsu) geleitet. Während der Aufzeichnungen wurde die Laserleistung für jedes Tier entsprechend der Luminanztransmissionseffizienz der implantierten optischen Faser eingestellt, um sicherzustellen, dass das an der Faserspitze emittierte Licht ~30 μw betrug, und die PMT-Spannungsverstärkung wurde auf 500 v für GCamp6s-Tiere und 300-350 v für Kontrolltiere eingestellt. Nach dem Start sendete die F-Scope-Software ein Auslösesignal, um die Videoaufzeichnung mit der Infrarotkamera zu starten. Die Emissionssignale wurden mit einem Tiefpassfilter von 30 Hz gefiltert und mit einer Datenerfassungskarte (USB6009, National Instrument) unter Verwendung einer von Biolink Optics bereitgestellten Software mit 500 Hz abgetastet. Bei einem gegebenen Versuch durften die Tiere zunächst ~5 Minuten lang erforschen, während dieser Zeit wurden die Grundliniensignale aufgezeichnet. Danach wurde ein Stimulus, wie z. B. ein hormonell stimuliertes ovarektomiertes Weibchen, ein falsches Plastikmausspielzeug, Welpen im Alter von P1-P4 oder Gummiblöcke in ähnlicher Größe wie die Welpen, eingeführt. Die Tiere durften 15-90 Minuten lang mit den Reizen interagieren und sich verhalten, bevor die Reize entfernt wurden, woraufhin die Signale für weitere ~5 Minuten aufgezeichnet wurden.
Optogenetische Hemmung
Die Tiere, die für optogenetische Hemmungsexperimente verwendet wurden, waren einzeln untergebracht. Männliche Mäuse wurden mit weiblichen Mäusen zusammen untergebracht, um vor den Versuchen sexuelle Erfahrungen zu sammeln oder Väter zu werden. Jungfräuliche weibliche Mäuse wurden als naive Tiere auf männertypische Paarung und auf mütterliches Verhalten getestet. War das mütterliche Verhalten während des ersten Tests unzureichend, wurden sie über Nacht zusammen mit den Welpen untergebracht und erneut auf mütterliches Verhalten getestet. Nach der Prüfung des mütterlichen Verhaltens wurden einige Weibchen etwa drei Wochen lang jeden zweiten Tag mit einer subkutanen Testosteroninjektion (100 μg in 50 μl Sonnenblumenöl, Shanghai Pharm.) behandelt, bevor sie erneut auf das männertypische Paarungsverhalten geprüft wurden. Weibchen, die als Mütter getestet wurden, wurden nach der Virusinjektion gepaart, um ihre eigenen Welpen zu produzieren.
Vor dem Verhaltenstest wurde ein duales faseroptisches Patchkabel (DFP_200/230/900-0.37_1m_DF0.9_2FCM, Doric Lense) verwendet, um eine 473-nm-Laserstromquelle (Shanghai Laser and Optics Century Co. oder Changchun New Industries Optoelectronics Tech Co, Ltd.) über ein Drehgelenk (FRJ 1 × 2i FC-2FC 0,22, Doric Lense) mit der implantierten dualen Lichtleitfaser (DFC_200/245-0,37_6,0mm_DF0,9_FLT, Doric Lense) verbunden, damit sich das Tier frei bewegen konnte. Nach ~10 Minuten Aufenthalt wurde die Kamera durch ein vom Master 9 gesendetes Signal ausgelöst, um den Verhaltensprozess aufzuzeichnen, was durch ein speziell geschriebenes MATLAB-Programm gesteuert wurde. Um nach der Annäherung Licht abzugeben, wurde automatisch Licht (~12 mW) ausgelöst, das kontinuierlich abgegeben wurde, solange das Programm feststellte, dass sich das getestete Tier innerhalb einer Körperlänge zum hormonell geprimten ovarektomierten Weibchen bei Tests zum Paarungsverhalten oder innerhalb der Welpenregion befand, die durch die Markierung eines etwas größeren Bereichs um jedes verstreute Jungtier bei Tests zum mütterlichen Verhalten definiert war. Für jeden Test wurden abwechselnd mindestens zwei Versuche mit Licht und zwei Versuche ohne Licht durchgeführt. Um Licht nach dem Auslösen bestimmter Verhaltensweisen zu erzeugen, wurde blaues Licht (~12 mW) von fester Dauer (5 oder 10 s) manuell ausgelöst, wenn der Versuchsleiter das betreffende Verhalten in Echtzeit beobachtete. Für jeden Test wurden abwechselnd ein oder zwei Lichtversuche durchgeführt.
Fluoreszenz-Immunfärbung
Die Tiere wurden mit 10 % Chloralhydrat betäubt und mit PBS transkardial perfundiert, gefolgt von eiskaltem 4 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS. Danach wurden die Gehirne mit einem Vibratom (VT1000S, Leica) in 40 μm dicke Schnitte geschnitten. Die Schnitte wurden gleichmäßig in mehrere Sätze aufgeteilt und für die Färbung aufbereitet oder direkt montiert. Die Hirnschnitte wurden in 5%igem Ziegenserum in AT (0,1% Triton und 2 mM MgCl2 in PBS) für 1 h bei Raumtemperatur blockiert und über Nacht bei 4 °C in AGT (0,5% normales Ziegenserum, 0.1% Triton und 2 mM MgCl2 in PBS) inkubiert, das geeignete primäre Antikörper enthält (Kaninchen anti-c-Fos, 1:2000, Santa Cruz, Kat. sc-52; Kaninchen anti-Esr154, 1:10.000, Millipore, Kat. 06-935). Am nächsten Tag wurden die Hirnschnitte dreimal mit AGT gewaschen (jeweils 30 Minuten) und mit den entsprechenden sekundären Antikörpern (Alexa Fluor 488 konjugiert, 1:1000; Cy3 konjugiert, 1:1000, Jackson ImmunoResearch) bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert. Die Hirnschnitte wurden mit Neuro Trace (Life Technologies, Kat. N21479, 1:300) oder DAPI (5 mg ml-1, 1:1000, Sigma) in AT gegengefärbt. Nach mehrmaligem Waschen in AGT, AT und PBS wurden die Hirnschnitte auf Glasobjektträger montiert.
DAB-Färbung
Die Hirnschnitte wurden ähnlich wie bei den Fluoreszenz-Immunfärbungsexperimenten präpariert und zur Blockierung der endogenen Peroxidase mit 3% H2O2 für 30 min bei Raumtemperatur vorbehandelt, zweimal für je 10 min in PBST (0.3% Triton X-100 in PBS) gewaschen, mit 5%igem Ziegenserum in PBST für 2 h bei Raumtemperatur blockiert und mit primärem anti-c-Fos-Antikörper (Kaninchen anti-c-fos, 1:2000, Santa Cruz, Cat# sc-52) in PBST über Nacht bei 4 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Schnitte sechsmal für jeweils 10 Minuten in PBST gewaschen und dann mit dem Biotin-konjugierten sekundären Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper (Kat. 111-065-003, Jackson ImmunoResearch) in PBST für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Waschen in PBS (je 5 Minuten) wurden die Hirnschnitte 30 Minuten lang mit dem VECTASTAIN® ABC Reagenz gemäß der Anleitung des Herstellers gefärbt. Nach zweimaligem 5-minütigem Waschen in PBS wurden die Hirnschnitte in einer 3,3-Diaminobenzidin-Lösung (Kat. Nr. D5637-5G, Sigma) mit Nickelverstärkung inkubiert, bis die gewünschte Färbeintensität erreicht war. Die Reaktion wurde durch Spülen der Schnitte mit Leitungswasser gestoppt. Die Hirnschnitte wurden auf Glasobjektträger montiert und unter ×4- oder ×10-Objektiven mit herkömmlichen Lichtmikroskopen aufgenommen.
In-situ-Hybridisierung
DNA-Vorlagen für die Erzeugung von In-situ-Sonden wurden unter Verwendung der folgenden Primer-Sets für jedes entsprechende Gen kloniert: Vgat, 5′-gccattcagggcatgttc-3′ und 5′-agcagcgtgaagaccacc-3′; Vglut2, 5′-atcgactagtccaaatcttacggtgctacctc-3′ und 5′-atcgctcgagtagccatctttcctgttccact-3′; Cre, 5′- ccaatttactgaccgtacacca-3′ und 5′-tatttacattggtccagccacc-3′; GAD1, 5′-cattgaggatagagaggttg-3′ und 5′-agagaagagcgaaggctact-3′; Galanin, 5′-atcctgcactgaccagcc-3′ und 5′-ttggcttgaggagttggc-3′. Anti-Sense-RNA-Sonden wurden mit T7-RNA-Polymerase (Promega, Kat.-Nr. P207E) und Digoxigenin (DIG)-markierten Nukleotiden transkribiert. Die Tiere wurden mit 10 % Chloralhydrat betäubt und mit DEPC-behandeltem PBS (D-PBS) transkardial perfundiert, gefolgt von eiskaltem 4 % Paraformaldehyd (PFA) in D-PBS. Danach wurden die Gehirne mit einem Vibratom (VT1000S, Leica) in 40 μm dicke Schnitte geschnitten. Die Hirnschnitte wurden 30 Minuten lang in 2XSSC-Puffer mit 0,1 % Triton gewaschen, 10 Minuten lang in 0,1 M Triethanolamin (pH 8,0) mit 0,25 % Essigsäureanhydrid (Vol./Vol.) acetyliert, 2 Stunden lang bei 65 ℃ in Prä-Hybridisierungslösung äquilibriert und anschließend mit 0,5 μg ml-1 spezifischer RNA-Sonden in Hybridisierungspuffer über Nacht bei 65 ℃ inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Schnitte jeweils 30 Minuten lang in Prä-Hybridisierungslösung und Prä-Hyb/TBST (TBS mit 0,1 % Tween-20) gespült. Anschließend wurden die Schnitte zweimal mit TBST und dreimal mit TAE jeweils 5 Minuten lang gewaschen. Die Schnitte wurden dann in Vertiefungen eines 2 %igen Agarosegels übertragen, die 2 Stunden lang in 1XTAE bei 60 V betrieben wurden, um nicht hybridisierte Sonden zu entfernen. Die Schnitte wurden dann zweimal in TBST gewaschen und anschließend mit Schaf-Anti-Digoxygenin-AP (1:2000, Roche, Kat.-Nr. 11093274910), manchmal zusammen mit Kaninchen-Anti-Esr1-Antikörper (1:3000, Millipore, Kat.-Nr. 06-935) für Co-Färbung, in 0,5%igem Blocking-Reagenz (Roche, 11096176001) bei 4 °C über Nacht inkubiert. Am zweiten Tag wurden die Schnitte für die Hellfeldfärbung gewaschen und mit NBT (Roche, Kat.-Nr. 11383213001) und BCIP (Roche, Kat.-Nr. 11383221001) für 4-10 h bei 37 ℃ gefärbt. Für die fluoreszierende In-situ-Hybridisierung in Kombination mit der Immunhistochemie wurden die Schnitte zunächst mit fluoreszierenden sekundären Antikörpern gefärbt, gefolgt von einer Färbung mit Fast Red (HNPP Fluorescent Detection Set, Roche, Kat. 11758888001) und einer Gegenfärbung mit DAPI (5 mg ml-1, 1:1000, Sigma) in PBS. Alle Schnitte wurden nach der Färbung gewaschen und auf Glasobjektträger montiert. Die Bilder wurden mit einem ×20-Objektiv unter einem konventionellen oder konfokalen Mikroskop aufgenommen.
catFISH
Die meisten Tiere, die für das catFish-Experiment verwendet wurden, waren erfahren. Für das Verfahren wurden den Tieren im Abstand von 30 Minuten zwei 5-minütige Episoden sozialer Interaktionen mit einem hormonell geprimten ovarektomierten Weibchen oder verstreuten Welpen ermöglicht. Unmittelbar nach der zweiten Episode wurden die Tiere mit 10 % Chloralhydrat betäubt und mit DEPC-PBS transkardial perfundiert, gefolgt von eiskaltem 4 % PFA in PBS. Die Gehirne wurden seziert und über Nacht bei 4 °C postfixiert und mit 30 % Saccharose in DPEC-PBS dehydriert. Anschließend wurden die Gehirne in 20 μm dicke Schnitte geschnitten und auf SuperFrost Plus® Objektträger (Fisher Scientific, Kat. Nr. 12-550-15) aufgezogen. Nach Trocknung an der Luft wurden die Objektträger bei -80 °C gelagert, bevor sie gemäß dem RNAscope® Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 User Manual (ACD Bio.) bearbeitet wurden. Die Sonden gegen c-Fos intron, c-Fos mRNA und Esr1 wurden bei ACD Bio. bestellt und im Experiment verwendet. Die Bilder wurden unter einem ×60-Objektiv mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen.
Elektrophysiologische Aufzeichnungen
C57BL/6-Tiere, denen AAVs injiziert wurden, die für ChR2-mCherry im mPOA kodieren, oder Esr1Cre-Mäuse, denen AAVs injiziert wurden, die für GtACR1 kodieren, wurden mit Isofluran betäubt und transkardial mit eiskalter, sauerstoffangereicherter (95% O2/5% CO2) Lösung mit hohem Saccharosegehalt perfundiert (Zusammensetzung in mM: 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 2 Na2HPO4, 2 MgSO4, 213 Saccharose, 26 NaHCO3). Nach der Präparation des Gehirns wurden koronale Schnitte einschließlich des mPOA mit einem Vibratom (VT-1200S, Leica) in eiskalter, sauerstoffangereicherter Schnittlösung bei 250 μm geschnitten. Die Hirnschnitte wurden dann in künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF; Zusammensetzung in mM: 126 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1,25 Na2HPO4, 2 MgSO4, 10 Glucose, 26 NaHCO3, 2 CaCl2) bei 34 °C für mindestens 1 Stunde inkubiert und bei Raumtemperatur aufgezeichnet. Die Zellen wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop identifiziert und mittels Infrarot-Differential-Interferenzkontrast (BX51, Olympus) sichtbar gemacht. Ganzzellstrommessungen wurden mit einem MultiClamp700B Verstärker und einer Digidata 1440A Schnittstelle (Molecular Devices) durchgeführt. Die Patch-Clamp-Elektrode (5-8 MΩ) wurde mit einer intrazellulären Lösung (Zusammensetzung in mM: 120 K-Gluconat, 4 KCl, 10 HEPES, 10 Natriumphosphokrit, 4 Mg-ATP und 0,3 Na3-GTP, pH:7,3, 265 mOsm) aufgefüllt. Für die optogenetische Aktivierung wurde blaues Licht (473 nm, 10 ms Breite, 14 mw mm-2, 40 Pulse) mit einer X-Cite LED-Lichtquelle (Lumen Dynamics) durch ein ×40-Objektiv auf die Schnitte übertragen. Die Spike-Treue in ChR2-exprimierenden Neuronen wurde gemessen, indem die Anzahl der Lichtpulse gezählt wurde, die erfolgreich Aktionspotenziale bei verschiedenen Frequenzen auslösten. Die Spike-Treue wurde über fünf Stimulationen gemittelt und aufgezeichnet. Für die optogenetische Inhibition wurde das Aktionspotenzial von GtACR1-exprimierenden Neuronen induziert, indem das Membranpotenzial mit einer Strominjektion auf -48 mW gehalten wurde, und es wurde wiederholt kontinuierliches blaues Licht auf die Hirnschnitte abgegeben.
Calcium-Imaging in Hirnschnitten
AAVs, die für ChR2 kodieren, und AAVs, die für GCamp6s kodieren, beide angetrieben durch hSyn, wurden gemeinsam in das mPOA von C57BL/6-Tieren injiziert. Akute Hirnschnitte, einschließlich des mPOA, wurden ähnlich wie die oben beschriebenen elektrophysiologischen Verfahren präpariert. Das Calcium-Imaging wurde mit einem Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop (Ultima, Prairie Instruments Inc.) mit einem 20X/0,95-NA XLUMPLFL-Wasserimmersionsobjektiv (Olympus) durchgeführt. Der Ti:Saphir-Laser wurde auf 940 nm eingestellt, und Bilder mit einer Größe von 512 × 512 Pixeln wurden durch einen 525/70 nm-Emissionsfilter mit einer Bildfrequenz von 1,2 Hz aufgenommen. Randomisierte Züge von 470-nm-Licht (10-ms-Puls, 15 s, 8,4 mW mm-2) mit unterschiedlichen Frequenzen (10 Hz, 20 Hz, 40 Hz) wurden in Intervallen von ~2 min auf die Schnitte gegeben. Die Bilder wurden mit ImageJ analysiert.
Hormonuntersuchungen
Rumpfblut wurde zum Zeitpunkt der Tötung vor der Perfusion entnommen. Das Serum wurde aufbereitet. Die Hormontiter wurden mit einem Testosteron-ELISA-Kit (DRG Instruments GmbH, Deutschland, Division of ARG international, Inc, Cat# EIA-1559) gemäß den Herstellerprotokollen bestimmt.
Datenanalyse
Alle Codes wurden in MATLAB geschrieben und für die Datenanalyse verwendet und sind auf Anfrage erhältlich. Es wurde keine Berechnung des Stichprobenumfangs durchgeführt. Die Anzahl der Zellen, die im Schnitt aufgezeichnet oder bei der Färbung gezählt wurden, und die Anzahl der Tiere, die für Verhaltenstests und Färbung verwendet wurden, wurden entsprechend der veröffentlichten Literatur über ähnliche Experimente gewählt. Datenpunkte von Tieren, die bei der histologischen Post-hoc-Analyse nach vorher festgelegten Kriterien als Fehltreffer eingestuft wurden, wurden von der Analyse ausgeschlossen. Insgesamt wurden drei weibliche Esr1Cre-Mäuse und eine männliche Esr1Cre-Maus, denen GtACR1 injiziert wurde, sowie eine männliche und eine weibliche VgatCre-Maus und eine weibliche Esr1Cre-Maus, denen Casp3 injiziert wurde, von der Analyse ausgeschlossen.
Um die Daten von Ca2+-Bildgebungsexperimenten in Gehirnschnitten zu analysieren, wurden die Bilder in ImageJ quantifiziert. GCaMP6s+-Zellen wurden manuell umrissen und die relativen Fluoreszenzänderungen (ΔF/F) wurden für jede Zelle mit der Gleichung ΔF/F = (F-F0)/F0 berechnet, wobei F0 die durchschnittliche Pixelintensität in den letzten 10 Bildern vor der Photostimulation und F die durchschnittliche Pixelintensität in den ersten 6 Bildern nach der Photostimulation ist. Bilder, die während der Photostimulationsperioden aufgenommen wurden, wurden von der Analyse ausgeschlossen. Eine aktivierte Zelle wurde operativ als Zelle definiert, die einen Anstieg von ΔF/F zeigte, der 5 Standardabweichungen von den durchschnittlichen ΔF/F-Werten entfernt war, die in 30 Bildern vor der ersten Photostimulation gemessen wurden.
Um die durch Licht hervorgerufene Fortbewegung zu analysieren, wurden zunächst Bewegungsspuren mit Hilfe benutzerdefinierter MATLAB-Codes extrahiert, die den Schwerpunkt eines Tieres erkennen. Die Bewegungsgeschwindigkeit wurde dann in Zeitabschnitten von 1 s durch Messung der zurückgelegten Strecke berechnet. Die 15 Datenpunkte der Bewegungsgeschwindigkeit während einer Photostimulationsperiode wurden mit den vorherigen 15 Punkten verglichen, um zu prüfen, ob die Lichtstimulation eine Geschwindigkeitszunahme in diesem Versuch verursachte. Auf der Ebene des Tieres wurden die Durchschnittswerte der Bewegungsgeschwindigkeiten während jeder Photostimulationsperiode mit den Durchschnittswerten der Bewegungsgeschwindigkeiten unmittelbar vor jeder Photostimulationsperiode verglichen, um festzustellen, ob die lichtinduzierte Fortbewegung bei diesem Tier zunimmt. Für die optogenetisch induzierte Montage und das Auffinden der Welpen wurden die Videos zunächst blind ausgewertet. Die Videoprotokolle wurden dann mit den Fotostimulationsprotokollen abgeglichen, um den Prozentsatz der Versuche, die Latenzzeit für den Beginn und die Gesamtdauer der evozierten Verhaltensweisen zu ermitteln. Nur Verhaltensweisen, die während der Lichtstimulation auftraten, wurden als optogenetisch induzierte Verhaltensweisen gezählt. Wenn ein Verhalten vor einer Photostimulationsperiode auftrat, aber dennoch in diese hineinreichte, wurde dieses Verhalten nicht als optogenetisch induziertes Verhalten gezählt. Die Parameter wurden immer über die Photostimulationsperioden desselben Verhaltensversuchs gemittelt, bei mehreren Versuchen auch über alle Versuche. Um die zeitliche Verteilung der optogenetisch hervorgerufenen Verhaltensweisen darzustellen, wurden nur die Photostimulationsperioden, in denen Verhaltensweisen auftraten, für den Durchschnitt herangezogen. Bei Verhaltensversuchen, bei denen ein Männchen, eine junge Ratte oder falsche Welpen als Stimulus verwendet wurden, oder wenn ChR2-Tiere kastriert wurden, wurden optogenetisch induzierte Verhaltensweisen mit spontanen Verhaltensweisen verglichen, die in dem 15-Sekunden-Zeitraum unmittelbar vor den Photostimulationsperioden auftraten.
Um die Wirkung der optogenetischen Hemmung auf ein bestimmtes Verhalten zu analysieren, wurden die Videos zunächst blind ausgewertet. Die Videoprotokolle wurden dann mit den Fotostimulationsprotokollen abgeglichen, um die Verhaltensereignisse zu extrahieren, die auf die Lichtstimulation trafen. Um verschiedene Parameter spezifischer Verhaltensweisen darzustellen, wurden die Verhaltensereignisse, die auf einen Lichtreiz trafen, auf der Ebene des Versuchs gemittelt, wenn mehrere Versuche vorhanden waren, und dann auf der Ebene des Tieres. Um die Häufigkeitsverteilung bestimmter Verhaltensweisen darzustellen, wurden nur Verhaltensereignisse analysiert, die auf Lichtstimulation trafen.
Um ein Aktivierungszentrum für ein ChR2-Tier zu simulieren, wurde ein 1100×1500 μm großer Bereich mit einer Seite nahe der Mittellinie und der senkrechten Seite nahe dem Boden des Gehirns aus jedem koronalen Hirnschnitt ausgeschnitten und auf 1 μm pro Pixel verkleinert. Die c-Fos-Signale in jedem 100×100 μm großen Abschnitt wurden halbautomatisch mit dem MATLAB-Programm und ImageJ extrahiert und entsprechend ihrer Position in jedem Abschnitt zu einer 11×15-Matrix summiert. Die durchschnittliche Anzahl der NeuN/HuCD+-Zellen innerhalb eines 100 μm2 großen Quadrats wurde auf ~25 geschätzt. Zur Berechnung der Koordinaten des Aktivierungszentrums entlang der lateral-medialen und dorsal-ventralen Achse wurden die Zahlen in der 11 × 15-Matrix über eine Reihe von Hirnschnitten gemittelt, die sich für jedes Tier anterior und posterior erstreckten, und mit einer zweidimensionalen Gauß-Funktion in MATLAB angepasst. Zur Berechnung der anterior-posterioren Koordinate des Aktivierungszentrums wurde die gesamte c-Fos-Zahl für jeden Hirnschnitt summiert und mit einer einzigen Gauß-Funktion angepasst.
Für Faserphotometrie-Experimente wurden die Fluoreszenz-Rohsignale entsprechend dem Gesamttrend weiter angepasst, um das Photo-Bleaching zu berücksichtigen. Versuche mit zittrigen, rechteckigen Signalen oder mit extrem niedrigem Signal-Rausch-Verhältnis wurden von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Für die anfängliche Reaktion wurden die Werte der Fluoreszenzänderung (ΔF/F) durch Berechnung von (F-F0)/F0 ermittelt, wobei F0 der Median des Fluoreszenzsignals der Basislinie ist. Für die Fluoreszenzsignale, die auf Verhaltensweisen ausgerichtet waren, wurden die Daten auf der Grundlage von Verhaltensereignissen innerhalb einzelner Versuche segmentiert, und die durchschnittlichen Signale 10-15 s vor Beginn des Verhaltens wurden als F0 verwendet. Zur Analyse der statistischen Signifikanz der beiden ereigniskorrelierten Fluoreszenzsignale wurde ein t-Test mit einer Falschentdeckungsrate (FDR) von 0,05 verwendet. Um Ca2+-Transienten und Verhaltensweisen zu korrelieren, wurde ein rampendes Ca2+-Ereignis gezählt, wenn die ΔF/F-Werte 3 Standardabweichungen über der Grundlinie lagen und länger als 2 s andauerten. Die Anzahl der Ca2+-Ereignisse wurde zwischen dem ersten und dem letzten Verhalten gezählt und mit der Anzahl der Verhaltensereignisse während dieses Zeitraums korreliert. Für die Korrelationsanalyse wurden nur Verhaltensversuche herangezogen, die mehr als zwei Montagen und mehr als einen Abruf umfassten.
Histologische Bilder wurden mit einem ×20-Objektiv auf einem konfokalen Mikroskop aufgenommen, sofern nicht anders angegeben. Die Bilder wurden in ImageJ mit eigens geschriebenen MATLAB-Codes verarbeitet und gezählt. Alle Zählungen wurden von Versuchsleitern durchgeführt, die weder das Geschlecht noch die Testbedingungen der Tiere kannten. Zur Analyse der viralen Expression von ChR2 wurde die gleichzeitige Markierung von ChR2, c-Fos und Nissl im zentralen Injektionsbereich manuell gezählt. Zur Analyse der gleichzeitigen Markierung von Esr1 und Vglut2, Vgat oder Galanin wurden fünf relativ feste Bereiche in fünf Hirnabschnitten an ähnlichen Positionen ausgewählt und manuell gezählt. Um die Spezifität der Cre-Expression in Esr1-cre-Tieren zu prüfen, wurde die gemeinsame Markierung von Esr1 und Cre in verschiedenen Bereichen mehrerer Hirnschnitte eines Tieres manuell gezählt. Zur Quantifizierung der Bilder von catFISH-Experimenten, die unter einem ×60-Objektiv aufgenommen wurden, wurden Zellen, die positiv für zytoplasmatisches oder nukleäres c-Fos und für Esr1 waren, mit DAPI als Gegenfärbung erkannt und manuell gezählt. Um die Auswirkungen der viralen Ablation von Esr1+ Neuronen zu quantifizieren, wurden Esr1+ Signale im mPOA, wie im Allen Brain Atlas definiert, für beide Seiten unter Verwendung von unvoreingenommener Stereologie mit Stereo Investigator Software (MBF bBioscience) gezählt. Unter Verwendung einer optischen Fraktionierungssonde wurden die Esr1+-Signale in einem 30×30 μm großen Zählfeld innerhalb eines 100×100 μm großen Abtastrasters gezählt. Um die Auswirkungen der viralen Ablation von Vgat+ oder Vglut2+ Neuronen zu quantifizieren, wurden Hirnschnitte mit einem ×10 Objektiv über Olympus VS120 abgebildet. Bereiche mit Vgat+- oder Vglut2+-Signalen in der mPOA und angrenzenden Regionen wurden halbautomatisch mit MATLAB-Codes extrahiert.
Statistik
Für Balkendiagramme werden die Daten als Mittelwert ± s.e.m. dargestellt. In Box- und Whisker-Diagrammen werden die Daten als Minimal- bis Maximal-Whisker dargestellt, wobei der Mittelwert durch ein „+“ und der Median durch eine horizontale Linie gekennzeichnet ist. Sofern nicht anders angegeben, wurden die folgenden statistischen Tests durchgeführt, und alle Tests wurden als zweiseitig angegeben. Kategoriale Daten wurden mit dem exakten Test von Fisher analysiert. Gepaarte Daten wurden mit dem Paartest analysiert. Zur Analyse der statistischen Unterschiede der Häufigkeitsverteilung wurde der Kolmogorov-Smirnov-Test mit zwei Stichproben durchgeführt. Daten mit einer unabhängigen Variablen wurden mittels einseitiger ANOVAs analysiert, gefolgt von einem Post-Hoc-Test mit Bonferroni-Korrektur. Daten mit zwei unabhängigen Variablen wurden mit Zwei-Wege-ANOVAs und anschließendem Post-Hoc-Test mit Bonferroni-Korrektur analysiert. Für andere Vergleiche wurden die Daten mit dem Lilliefors-Normalitätstest auf ihre Verteilung geprüft. Wenn die Daten den Normalitätstest bestanden, wurde ein parametrischer Test (Student’s t-Test) verwendet. Andernfalls wurde der nichtparametrische Wilcoxon-Rangsummentest verwendet. Der p-Wert und der Korrelationskoeffizient für die Pearson-Korrelation wurden unter Verwendung einer Student’s t-Verteilung für eine Transformation der Korrelation berechnet. *p < 0,05, **p ≤ 0,01, ***p < 0,001.
Datenverfügbarkeit
Alle Daten aus dieser Studie sind auf Anfrage erhältlich.