Állatok
C57BL/6J állatokat a Jackson Laboratory, Slac Laboratory Animal (Shanghai) laboratóriumból vásárolták és házilag tenyésztették. Az Esr1-2a-Cre (Esr1Cre, #017913) és a Vglut2-Ires-Cre (Vglut2Cre, #012569) a Jackson Laboratóriumtól származott. A Vgat-Cre (VgatCre) vonalat korábban generáltuk68. Minden Cre-vonalat legalább egy generáción keresztül C57BL/6J háttérre tenyésztettünk. Az állatokat az Idegtudományi Intézet állattartó létesítményében tartották 12 óra:12 óra fény/sötét ciklusban, ad libitum élelemmel és vízzel. A vizsgálatban csak a Cre allél heterozigóta állatokat használtuk fel. Minden kísérleti protokollt a Kínai Tudományos Akadémia Idegtudományi Intézetének Állatgondozási és -felhasználási Bizottsága hagyott jóvá (IACUC No. NA-016-2016).
Műtét
A 2-4 hónapos felnőtt egereket izofluránnal (0,8-5%) altattuk és sztereotaxiás keretbe helyeztük (David Kopf Instrument, 1900-as modell). Szemkenőcsöt alkalmaztunk a kiszáradás megelőzésére. A koponyát egy kis bemetszéssel feltártuk, és lyukakat fúrtunk a vírus üvegpipettákkal (15-25 μm átmérőjű a hegyénél) történő befecskendezéséhez és az optikai szálak beültetéséhez. A vírus mPOA-ba történő bejuttatásának koordinátái a következők voltak: AP, -0,16 mm; ML, ±0,4 mm; DV, -5,150 mm (Paxios és Franklin egér agyatlasz, 2. kiadás). Oldalanként 100-400 nl vírust fecskendeztünk be 70 nl/perc áramlási sebességgel egy házilag készített nanoliteres injektorral vagy 40 nl/perc sebességgel egy hidraulikus pumpa (Harvard Apparatus) segítségével. Az üvegpipettákat az injekció beadása után ~10 percig a helyén hagytuk, mielőtt visszahúztuk volna. A mono optikai szálakat (átmérő, 200 μm; N.A., 0,37; hossz, 6 mm; AniLab Software and Instruments Co., Ltd.) vagy kettős optikai szálakat (DFC_200/245-0,37_6,0mm_DF0,9_FLT; Doric Lense) 400 μm-re helyeztük a vírusinjekció helye fölé az optogenetikai kísérletekhez vagy 50 μm-re a szálfotometriai felvételekhez. Az optikai szálakat fogcementtel és koponyacsavarokkal rögzítették. Az alomtestvéreket véletlenszerűen választottuk ki a kísérleti vagy a kontroll vírus injekciózására. A kasztrációs műtéteket ketamin (80 mg kg-1) és xilazin (8 mg kg-1) intraperitoneális (i.p.) injekciójával érzéstelenített állatokkal végeztük. Az állatoknak a műtétek után 3-4 hetet hagytunk a felépülésre a későbbi viselkedési tesztek előtt.
Vírus
Viselkedési vizsgálatok
Minden viselkedési tesztet legalább fél órával a sötét ciklus kezdete után kezdtünk el, és infravörös kamerával rögzítettük 25 Hz-es képkockasebességgel, és a kísérleti személyek az érintett állatok genotípusára, csoportinformációira vagy fotostimulációs státuszára vakon értékelték. Az optogenetikai gátlási kísérletekben használt állatok kivételével minden viselkedést vizsgált állat a vizsgálatot megelőzően naiv szűz egér volt. Az optogenetikai gátlási kísérletekben az összes hím egeret nőstény egerekkel együtt tartották, és néhányuk a vizsgálat előtt apává vált, míg néhány nőstényt kölykökkel együtt tartottak, vagy párosítottak, hogy anyává váljanak, vagy a vizsgálat előtt több hetes tesztoszteron injekcióval kezelték őket. Az optogenetikai aktiválási kísérletekben használt állatok kivételével minden állatot a viselkedési tesztek előtt 3-7 nappal egyedül tartottunk.
A párzási viselkedési tesztekhez egy hormonális alapozású, ovariektomizált C57BL/6 nőstényt vittünk be a házi ketrecbe, és 30 percig videóra vettük. A párzási viselkedési teszteket háromszor ismételtük meg különböző ingerállatokkal, legalább három nap különbséggel. A szülői viselkedést úgy teszteltük, hogy három P1 és P4 közötti korú kölyköt szétszórtunk a fészek szélén a fészektől távolabb, és az állatot ~15 percig videóra vettük, és 2-3 alkalommal megismételtük. A territoriális agressziót úgy teszteltük, hogy a Slac Laboratory Animal (Shanghai) cégtől vásárolt Balb/c foltú betolakodó egeret vittünk be a vizsgált állat házi ketrecébe, és ~15 percig videóra vettük.
A videókat képkockánként kézzel kommentáltuk egy saját készítésű MATLAB program segítségével, a korábban leírtak szerint8. A viselkedéseket a következő kritériumok szerint pontoztuk: a vizsgált állatok által kezdeményezett orr-arc, orr-test vagy orr-urogenitális kontaktusokat együttesen “szociális vizsgálódásként” pontoztuk, amelyek közül az orr-urogenitális kontaktust kifejezetten “kemovizsgálatként”, más néven “szimatolásként” definiáltuk. A “felkapaszkodást” akkor pontozzák, amikor a kísérleti állat mellső végtagjait az inger hátára helyezi, felmászik rá és mozgatja a medencéjét. A felszállás utáni ritmikus medencemozgásokat “medencetolásként” pontozzák. A rezidens által a hím betolakodó felé kezdeményezett cselekvéseket, beleértve a lökéseket, harapásokat, bukfenceket, “Támadás”-ként pontozzák. A “kölyökkontaktust” akkor pontozzák, ha az állat orrával vagy szájával érintkezett egy kölyökkel. A “kölyök visszaszerzése” akkor kerül pontozásra, amikor az állat a szájával megfogja a kölyköt, és általában a fészek felé halad. A “guggolást” akkor pontozzák, amikor az állat a hátát meggörbíti és a fészekben lévő kölykök felett lebeg. A kölyköket a viselkedési próba után mindig megvizsgálták az esetleges sérülések szempontjából. A viselkedési próbák körülbelül 2%-a vezetett sérült kölykökhöz. Ezeknek a kísérleteknek a kizárása nem befolyásolta a következtetéseket.
Optogenetikai aktiválás
Az optogenetikai kísérletekhez használt állatok csoportos elhelyezésben voltak. A viselkedési teszt napján új ketrecbe kerültek. Egy külső optikai szál segítségével egy 473 nm-es lézer áramforrást (Shanghai Laser and Optics Century Co. vagy Changchun New Industries Optoelectronics Tech Co., Ltd.) csatlakoztattunk az állatba beültetett optikai szálhoz. A külső optikai szál egy forgócsuklóhoz (FRJ_1 × 1_FC_FC, Doric Lense) volt csatlakoztatva, hogy az állat szabadon viselkedhessen. A vizsgált állatot ~15 percig engedtük felfedezni a ketrecet a külső szál csatlakoztatásával. Ezután egy egyedi MATLAB programot indítottunk el egy Master 9 (A.M.P.I.) vezérlésére, amely a kamerából a felvétel elindításához triggereket küldött, és jeleket a lézerhez, hogy 15 s fotostimulációt adjon 40 Hz 12 mW vagy 20 Hz 5 mW-os frekvenciával, véletlenszerűen 90-120 s időközzel. A lézer teljesítményét minden egyes állat esetében a beültetett optikai szál beültetés előtt mért fénysugár-átviteli hatékonyságának megfelelően állítottuk be, hogy biztosítsuk a szál csúcsán kibocsátott fény teljesítményét. A lézeres stimuláció során az állatokat vagy egyedül vizsgálták a lokomóciót, vagy egy hormonális alapozású ovariektomizált nősténnyel, egy C57BL/6 hímmel, egy P13-P15 korú fiatal patkánnyal, P1-P4 korú kölykökkel, vagy a kölykökhöz hasonló méretű gumiblokkokkal, mint az inger. Minden egyes vizsgálat során öt-tizenkét ingerlést adtunk. Az egyes ingerekkel (3-5 perces időközzel) minden egyes napon egy-négy vizsgálatot végeztünk minden egyes állat esetében. Az összes viselkedési próba befejezése után az állatoknak sorozatos fénystimulációt adtunk (15 s, 12 mW, 40 Hz, 10 alkalommal, rögzített 105 s intervallummal), és egy órával a fénystimuláció után transzkardiálisan perfundáltuk őket 4%-os paraformaldehiddel a szövettani elemzéshez. Az öléskor vért is vettek a hormonális mérésekhez.
Szálfotometria
A szálfotometriás kísérletekhez használt állatokat a viselkedési vizsgálat előtt 3-7 nappal egyenként helyezték el. A vizsgálat napján a beültetett optikai szál egy külső optikai szálon keresztül csatlakozott az F-scope-hoz (Biolink Optics Technology Inc., Peking), egy integrált szálfotometriás rögzítő berendezéshez. Az F-skópban egy 488 nm-es gerjesztő lézer (OBIS 488LS; Coherent) tükröződik vissza egy dichroikus tükörről (MD498, Thorlabs). A beültetett optikai szálon keresztül gyűjtött emissziós jeleket sávszűrővel (MF525-39, Thorlabs) szűrjük, és egy fotomultiplier csőre (PMT, R3896, Hamamatsu) irányítjuk. A felvételek során a lézer teljesítményét minden egyes állat esetében a beültetett optikai szál fénysugár-átviteli hatékonyságának megfelelően állítottuk be, hogy a szál csúcsán kibocsátott fény ~30 μw legyen, a PMT feszültségerősítését pedig a GCamp6s állatok esetében 500 v-ra, a kontroll állatok esetében pedig 300-350 v-ra állítottuk be. Az indítást követően az F-scope szoftver egy trigger jelet küldött az infravörös kamera videofelvételének elindításához. Az emissziós jeleket 30 Hz-es aluláteresztő szűréssel és 500 Hz-es mintavételezéssel egy adatgyűjtő kártyával (USB6009, National Instrument), a Biolink Optics által biztosított szoftver segítségével rögzítettük. Egy adott kísérlethez az állatokat először ~5 percig engedtük felfedezni, amely idő alatt az alapjeleket rögzítettük. Ezt követően olyan ingereket vezettek be, mint egy hormonálisan primed ovariektomizált nőstény, egy hamis műanyag egérjáték, P1-P4 korú kölykök vagy a kölykökhöz hasonló méretű gumitömbök. Az állatok az ingerek eltávolítása előtt 15-90 percig interakcióba léphettek és viselkedhettek az ingerekkel, majd a jeleket további ~5 percig rögzítettük.
Optogenetikus gátlás
Az optogenetikus gátlási kísérletekben használt állatok egyszemélyes tartásban voltak. A hím egereket nőstényekkel együtt tartották, hogy a vizsgálat előtt szexuális tapasztalatot szerezzenek vagy apává váljanak. A szűz nőstény egereket naiv állatokként teszteltük a hímekre jellemző párosodás és az anyai viselkedés szempontjából. Abban az esetben, ha a kezdeti teszt során gyenge anyai viselkedést mutattak, a kölykökkel együtt tartottuk őket egy éjszakán át, és újra teszteltük őket anyai viselkedés szempontjából. Az anyai viselkedés tesztelése után néhány nőstényt kétnaponta tesztoszteron szubkután injekcióval (100 μg 50 μl napraforgóolajban, Shanghai Pharm.) kezeltek kb. 3 héten keresztül, mielőtt újra tesztelték a hímtípusos párzást. Az anyaként tesztelt nőstényeket a vírusinjekció beadása után párosították, hogy saját kölykeiket hozzák létre.
A viselkedési teszt előtt egy kettős száloptikai patchkábelt (DFP_200/230/900-0.37_1m_DF0.9_2FCM, Doric Lense) használtak egy 473 nm-es lézer teljesítményforrás (Shanghai Laser and Optics Century Co. vagy Changchun New Industries Optoelectronics Tech Co, Ltd.) a beültetett kettős optikai szálhoz (DFC_200/245-0.37_6.0mm_DF0.9_FLT, Doric Lense) az állatba egy forgócsuklón keresztül (FRJ 1 × 2i FC-2FC 0.22, Doric Lense), hogy az állat szabadon viselkedhessen. ~10 perc tartózkodási idő után a kamerát a viselkedési folyamat rögzítésére a Master 9-ről küldött jel segítségével indítottuk el, amelyet egy saját készítésű MATLAB programmal vezéreltünk. A közeledést követő fényszállításhoz a fény (~12 mW) automatikusan beindult, hogy folyamatosan leadásra kerüljön mindaddig, amíg a vizsgált állat pozícióját a program úgy érzékelte, hogy az egy testhosszon belül volt a hormonálisan előkészített ovariektomizált nőstényhez a párzási viselkedési tesztekben, vagy a kölyök régióján belül, amelyet az anyai viselkedési tesztekben az egyes szétszórt kölyköket körülvevő kissé nagyobb terület megjelölésével határoztunk meg. Minden egyes vizsgálatnál legalább két fénypróbát és két fény nélküli próbát végeztek felváltva. A meghatározott viselkedések megkezdése utáni fénykibocsátáshoz a meghatározott hosszúságú (5 vagy 10 s) kék fényt (~12 mW) manuálisan indítottuk el, amikor a kísérletvezető valós időben megfigyelte az érdeklődésre számot tartó viselkedést. Minden teszthez egy vagy két fénypróbát végeztünk felváltva.
Fluoreszcens immunfestés
Az állatokat 10% klorálhidráttal altattuk, és transzkardiálisan perfundáltuk PBS-szel, majd jéghideg 4%-os paraformaldehiddel (PFA) PBS-ben. Ezt követően az agyakat 40 μm vastagságban szeleteltük vibratom (VT1000S, Leica) segítségével. A metszeteket egyenlően több készletre osztottuk, és festéshez feldolgoztuk vagy közvetlenül montíroztuk. Az agymetszeteket 5%-os kecskeszérumban AT-ben (0,1% Triton és 2 mM MgCl2 PBS-ben) 1 órán át szobahőmérsékleten blokkoltuk, majd egy éjszakán át 4 °C-on AGT-ben (0,5% normál kecskeszérum, 0.1% Triton és 2 mM MgCl2 PBS-ben), amely megfelelő primer antitestet tartalmaz (nyúl anti-c-Fos, 1:2000, Santa Cruz, Cat# sc-52; nyúl anti-Esr154, 1:10 000, Millipore, Cat# 06-935). Másnap az agymetszeteket háromszor mostuk AGT-vel (egyenként 30 percig), majd megfelelő másodlagos antitestekkel (Alexa Fluor 488 konjugált, 1:1000; Cy3 konjugált, 1:1000, Jackson ImmunoResearch) inkubáltuk szobahőmérsékleten 2 órán át. Az agymetszeteket ellenfestettük Neuro Trace (Life Technologies, Cat# N21479, 1:300) vagy DAPI (5 mg ml-1, 1:1000, Sigma) AT-ben. Többszöri AGT-ben, AT-ben és PBS-ben történő mosás után az agymetszeteket üveglemezekre szereltük.
DAB festés
Az agymetszeteket a fluoreszcens immunfestési kísérletekhez hasonlóan készítettük el, és az endogén peroxidáz blokkolása érdekében 30% H2O2-vel előkezeltük 30 percig szobahőmérsékleten, majd kétszer 10 percig mostuk őket PBST-ben (0.3% Triton X-100 PBS-ben), majd 5%-os kecskeszérummal blokkoltuk PBST-ben 2 órán át szobahőmérsékleten, és elsődleges anti-c-Fos antitesttel (Rabbit anti-c-fos, 1:2000, Santa Cruz, Cat# sc-52) inkubáltuk PBST-ben egy éjszakán át 4 °C-on. Másnap a metszeteket hatszor mostuk PBST-ben, egyenként 10 percig, majd biotin-konjugált kecske antinyúl másodlagos antitesttel (Cat#111-065-003, Jackson ImmunoResearch) inkubáltuk PBST-ben 2 órán át szobahőmérsékleten. Három, egyenként 5 perces PBS-ben történő mosás után az agyi metszeteket VECTASTAIN® ABC reagenssel festettük 30 percig a gyártó kézikönyvét követve. Két 5 perces PBS-ben történő mosás után az agyszelvényeket 3,3-diaminobenzidin (Cat# D5637-5G, Sigma) oldatban inkubáltuk nikkeles intenzifikációval a kívánt festési intenzitás eléréséig. A reakciót csapvízben történő öblítéssel állítottuk le. Az agyi metszeteket üveglemezekre szereltük, és ×4 vagy ×10 objektívek alatt hagyományos fénymikroszkópokkal rögzítettük.
In situ hibridizáció
Az in situ szondák előállításához szükséges DNS-templátokat az egyes megfelelő génekhez a következő primer-készletekkel klónoztuk: Vgat, 5′-gccattcagggcatgttc-3′ és 5′-agcagcagcgtgaagaccacc-3′; Vglut2, 5′-atcgactagtccaaatcttacggtgctacctc-3′ és 5′-atcgctcgagtagccatctctttcctgttgttccact-3′; Cre, 5′- ccaatttactgaccgtaccgtacacca-3′ és 5′-tatttacattggtccagagccacc-3′; GAD1, 5′-cattgaggaggagatagagagaggttg-3′ és 5′-agagaagagcgaagggctact-3′; Galanin, 5′-atcctgcactgaccagcc-3′ és 5′-ttggcttgaggagttggc-3′. Az anti-szenz RNS-szondákat T7 RNS-polimerázzal (Promega, Cat# P207E) és digoxigeninnel (DIG) jelölt nukleotidokkal írtuk át. Az állatokat 10%-os klorálhidráttal altattuk, és transzkardiálisan DEPC-vel kezelt PBS-szel (D-PBS), majd jéghideg 4%-os paraformaldehiddel (PFA) D-PBS-ben perfundáltuk. Ezt követően az agyakat 40 μm vastagságban szeleteltük vibratóm (VT1000S, Leica) segítségével. Az agymetszeteket 0,1% tritont tartalmazó 2XSSC pufferben mostuk 30 percig, 0,1 M trietanolaminban (pH 8,0) 0,25% ecetsav-anhidriddel (vol/vol) 10 percig acetileztük, előhibridizációs oldatban 2 órán át 65 ℃-on egyensúlyoztuk, majd 0,5 μg ml-1 specifikus RNS-szondákkal inkubáltuk hibridizációs pufferben egy éjszakán át 65 ℃-on. Másnap a metszeteket előhibridizációs oldatban és pre-hyb/TBST-ben (TBS 0,1% tween-20-mal) öblítettük egyenként 30 percig. Ezután a metszeteket kétszer TBST-vel és háromszor TAE-vel mostuk, egyenként 5 percig. A metszeteket ezután 2%-os agaróz gélben lévő lyukakba helyeztük át, amelyeket 1XTAE-ben 60 V-on 2 órán keresztül futtattunk a nem hibridizált szondák eltávolítása érdekében. A metszeteket ezután kétszer mostuk TBST-ben, majd juh anti-digoxigenin-AP (1:2000, Roche, Cat# 11093274910), néha nyúl anti-Esr1 antitesttel (1:3000, Millipore, Cat# 06-935) együtt inkubáltuk a kofestés céljából, 0,5%-os blokkoló reagensben (Roche, 11096176001) 4 °C-on egy éjszakán át. A második napon a világosmezős festéshez a metszeteket mostuk és festettük NBT-vel (Roche, Cat# 11383213001) és BCIP-vel (Roche, Cat# 11383221001) 4-10 órán keresztül 37 ℃-on. Az immunhisztokémiával kombinált fluoreszcens in situ hibridizációhoz a metszeteket először fluoreszcens másodlagos antitestekkel festettük, majd gyorsvörössel (HNPP Fluorescent Detection Set, Roche, Cat# 11758888001) festettük, és DAPI-val (5 mg ml-1, 1:1000, Sigma) ellenfestettük PBS-ben. A festés után minden metszetet megmostunk és üveglemezre rögzítettünk. A képeket ×20 objektívvel készítettük hagyományos vagy konfokális mikroszkóp segítségével.
catFISH
A catFish kísérletben használt állatok többsége tapasztalt volt. Az eljáráshoz az állatok két 5 perces epizódot kaptak szociális interakcióra egy hormonálisan prímelt ovariektomizált nősténnyel vagy szórt kölykökkel, 30 perc különbséggel. Közvetlenül a második epizód után az állatokat 10%-os klorálhidráttal elaltattuk, és transzkardiálisan DEPC-PBS-szel, majd jéghideg 4%-os PFA-val PBS-ben perfundáltuk. Az agyakat felboncoltuk, majd egy éjszakán át 4 °C-on posztfixáltuk, és 30%-os szacharózzal dehidratáltuk DPEC-PBS-ben. Ezt követően az agyakat 20 μm vastagságban metszettük és SuperFrost Plus® tárgylemezekre (Fisher Scientific, Cat. No. 12-550-15) rögzítettük. A levegőn történő szárítás után a tárgylemezeket -80 °C-on tároltuk, mielőtt az RNAscope® Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 felhasználói kézikönyv (ACD Bio.) szerint feldolgoztuk volna. A c-Fos intron, a c-Fos mRNS és az Esr1 ellenes próbákat az ACD Bio.-tól rendeltük és használtuk a kísérletben. A képeket ×60-as objektívvel készítettük konfokális mikroszkóppal.
Elektrofiziológiai felvételek
A mPOA-ban ChR2-mCherry-t kódoló AAV-val injektált C57BL/6 állatokat vagy a GtACR1-et kódoló AAV-val injektált Esr1Cre egereket izofluránnal altattuk és transzkardiálisan jéghideg, oxigenizált (95% O2/5% CO2), magas szacharóz tartalmú oldattal (összetétel mM-ben: 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 2 Na2HPO4, 2 MgSO4, 213 szacharóz, 26 NaHCO3). Az agy felboncolása után az mPOA-t is tartalmazó koronális metszeteket 250 μm-es vastagságban vágtuk vibratóm (VT-1200S, Leica) segítségével, jéghideg, oxigénnel dúsított vágóoldatban. Az agyszeleteket ezután mesterséges cerebrospinális folyadékban (ACSF; összetétel mM-ben: 126 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1,25 Na2HPO4, 2 MgSO4, 10 glükóz, 26 NaHCO3, 2 CaCl2) 34 °C-on legalább 1 órán át inkubáltuk, majd szobahőmérsékleten rögzítettük. A sejteket fluoreszcens mikroszkóp alatt azonosítottuk és infravörös differenciális interferencia kontraszt (BX51, Olympus) segítségével vizualizáltuk. Az egészsejtes current clamp felvételeket MultiClamp700B erősítővel és Digidata 1440A interfésszel (Molecular Devices) végeztük. A patch-clamp elektródát (5-8 MΩ) intracelluláris oldattal (összetétel mM-ben: 120 K-glükonát, 4 KCl, 10 HEPES, 10 nátrium-foszfokritin, 4 Mg-ATP és 0,3 Na3-GTP, pH:7,3, 265 mOsm) töltöttük vissza. Az optogenetikai aktiváláshoz kék fényt (473 nm, 10 ms szélesség, 14 mw mm-2, 40 impulzus) juttattunk a szeletekre ×40 objektíven keresztül egy X-Cite LED fényforrással (Lumen Dynamics). A ChR2-expresszáló neuronok spike fidelitását a különböző frekvenciájú akciós potenciálokat sikeresen kiváltó fényimpulzusok számának számlálásával mértük. A spike fidelitást öt ingerlésen keresztül átlagoltuk és ábrázoltuk. Az optogenetikai gátláshoz a GtACR1-expresszáló neuronok akciós potenciálját úgy indukáltuk, hogy a membránpotenciált -48 mW-os áraminjekcióval visszatartottuk, és ismételt folyamatos kék fényt juttattunk a szeletekre.
Kalcium képalkotás agyszeletekben
A ChR2-t és GCamp6s-t kódoló, hSyn által vezérelt AAV-okat együtt injektáltuk C57BL/6 állatok mPOA-jába. Az mPOA-t is tartalmazó akut agyszeleteket a fent leírt elektrofiziológiai eljárásokhoz hasonlóan készítettük el. A kalcium képalkotását kétfotonos lézerpásztázó mikroszkóppal (Ultima, Prairie Instruments Inc.) végeztük 20X/0,95-NA XLUMPLFL vízimmersziós objektívvel (Olympus). A Ti:zafír lézert 940 nm-re hangoltuk, és az 512 × 512 pixel méretű képeket 525/70 nm-es emissziós szűrőn keresztül, 1,2 Hz képkockasebességgel vettük fel. A szeletekre különböző frekvenciájú (10 Hz, 20 Hz, 40 Hz), véletlenszerű 470 nm-es fénysorozatokat (10 ms impulzus, 15 s, 8,4 mW mm-2) juttattunk ~2 perces időközönként. A képeket az ImageJ segítségével elemeztük.
Hormonvizsgálatok
A törzsi vért a perfúzió előtt, az öléskor vettük le. Szérumot készítettünk. A hormontitereket tesztoszteron ELISA kit (DRG Instruments GmbH, Németország, Division of ARG international, Inc, Cat# EIA-1559) segítségével vizsgáltuk a gyártó protokollja szerint.
Adatelemzés
Minden kódot MATLAB-ban írtunk és használtunk az adatelemzéshez, és kérésre rendelkezésre áll. Mintavételi méretszámítást nem végeztünk. A szeletben rögzített vagy a festés során megszámlált sejtek számát, valamint a viselkedési tesztekhez és a festéshez használt állatok számát a hasonló kísérletek publikált irodalma alapján választottuk. Az elemzésből kizártuk azon állatok adatpontjait, amelyek a poszt hoc szövettani elemzés során az előre meghatározott kritériumok szerint téves találatnak minősültek. Összesen három nőstény Esr1Cre egeret és egy hím Esr1Cre egeret GtACR1 injekcióval, egy hím és egy nőstény VgatCre és egy nőstény Esr1Cre egeret Casp3 injekcióval zártunk ki az elemzésből.
Az agyszeletekben végzett Ca2+ képalkotási kísérletek adatainak elemzéséhez a képeket az ImageJ programban számszerűsítettük. Röviden, a GCaMP6s+ sejteket manuálisan körvonalazni kellett, és a relatív fluoreszcencia-változást (ΔF/F) minden egyes sejtre a ΔF/F = (F-F0)/F0 egyenlet segítségével számoltuk ki, amelyben F0 az átlagos pixelintenzitás a fotostimuláció előtti utolsó 10 képkockán, F pedig az átlagos pixelintenzitás a fotostimulációt követő első 6 képkockán. A fotostimulációs időszakok alatt készült képeket kizártuk az elemzésből. Az aktivált sejtet operatívan úgy definiáltuk, mint olyan sejteket, amelyeknél a ΔF/F növekedése 5 szórásnyira volt az első fotostimulációt megelőző 30 képkockán mért átlagos ΔF/F értékektől.
A fény által kiváltott mozgás elemzéséhez a mozgásnyomokat először egyedi MATLAB-kódok segítségével extraháltuk, amelyek felismerik az állat centroidját. Ezután a mozgás sebességét 1 s-os időintervallumokban számoltuk ki a megtett távolság mérésével. A fénystimulációs periódus alatti 15 mozgássebesség-adatpontot összehasonlítottuk az előző 15 ponttal, hogy megvizsgáljuk, hogy a fénystimuláció indukált-e sebességnövekedést az adott kísérletben. Az állatok szintjén az egyes fotostimulációs időszakok alatti mozgássebességek átlagát összehasonlítottuk az egyes fotostimulációs időszakokat közvetlenül megelőző mozgássebességek átlagával, hogy megállapítsuk, hogy a fény által indukált helyváltoztatás növekedett-e az adott állatban. Az optogenetikai indukcióval kiváltott szerelés és a kölykök visszahívása esetén a videókat először vakon pontozták. A videónaplókat ezután összehangoltuk a fotostimulációs naplókkal, hogy kivonjuk a próbák százalékos arányát, a kezdeti latenciát és a kiváltott viselkedések teljes időtartamát. Optogenetikusan kiváltott viselkedésnek csak a fénystimuláció során bekövetkezett viselkedéseket tekintettük. Ha egy viselkedés a fénystimulációs időszak előtt történt, de mégis beleszaladt a fénystimulációs időszakba, az ilyen viselkedést nem számoltuk optogenetikusan indukált viselkedésnek. A paramétereket mindig átlagoltuk az azonos viselkedési kísérletben lévő fotostimulációs periódusok között, majd több kísérlet esetén a kísérletek között. Az optogenetikusan kiváltott viselkedések időbeli eloszlásának ábrázolásához csak azokat a fotostimulációs periódusokat használtuk az átlagoláshoz, amelyekben a viselkedések előfordultak. Azokban a viselkedési próbákban, amelyekben hím, fiatal patkány vagy álkölyök volt az inger, vagy amikor a ChR2 állatokat ivartalanították, az optogenetikusan kiváltott viselkedéseket a spontán viselkedésekkel hasonlítottuk össze, amelyek a fotostimulációs periódusokat közvetlenül megelőző 15 s-os időszakban történtek.
Az optogenetikus gátlás specifikus viselkedésre gyakorolt hatásának elemzéséhez a videókat először vakon pontoztuk. A videónaplókat ezután összehangolták a fotostimulációs naplókkal, hogy kivonják a fénystimulációval találkozó viselkedési eseményeket. A specifikus viselkedések különböző paramétereinek ábrázolásához a fénystimulációval találkozó viselkedési eseményeket a kísérlet szintjén átlagoltuk, ha több kísérlet létezett, majd az állat szintjén. A specifikus viselkedések halmozódási eloszlásának ábrázolásához csak a fénystimulációval találkozó viselkedési eseményeket elemeztük.
A ChR2 állat aktivációs központjának szimulálásához egy 1100×1500 μm-es területet vágtunk ki minden egyes koronális agymetszetből, amelynek egyik oldala közel volt a középvonalhoz, a rá merőleges oldal pedig közel az agy aljához, majd átméreteztük 1 μm per pixelre. A c-Fos jeleket minden 100×100 μm-es területen félautomatikusan kivontuk a MATLAB program és az ImageJ segítségével, és az egyes metszeteken belüli elhelyezkedésüknek megfelelően egy 11 × 15-ös mátrixba összegeztük. A NeuN/HuCD+ sejtek átlagos számát egy 100 μm2 -es négyzetben ~25-re becsültük. Az aktivációs központ koordinátáinak kiszámításához a laterális-mediális és dorzális-ventrális tengely mentén a 11 × 15 mátrixon belüli számokat átlagoltuk az egyes állatok elülső és hátsó részén átívelő agyi szelvények sorozatában, és kétdimenziós Gauss-függvénnyel illesztettük a MATLAB-ban. Az aktivációs központ elülső-hátsó koordinátájának kiszámításához a teljes c-Fos-számot minden egyes agyszelvényre összegeztük, és egyetlen Gauss-függvénnyel illesztettük.
A szálfénymérési kísérletek esetében a nyers fluoreszcenciajeleket az általános trendnek megfelelően tovább igazítottuk a fotófehérítés figyelembevétele érdekében. A jitteres, négyszögletes jeleket tartalmazó vagy rendkívül alacsony jel/zaj arányú kísérleteket kizártuk a további elemzésből. A kezdeti válasz esetében a fluoreszcencia-változás (ΔF/F) értékeit (F-F0)/F0 kiszámításával vezettük le, ahol F0 az alapvonalbeli fluoreszcenciajel mediánja. A viselkedéshez igazított fluoreszcenciajelek esetében az adatokat az egyes próbákon belüli viselkedési események alapján szegmentáltuk, és a viselkedés megkezdése előtti 10-15 s-os jelek átlagát használtuk F0-ként. A két eseményhez kapcsolódó fluoreszcenciajel statisztikai szignifikanciájának elemzéséhez t tesztet használtunk 0,05-ös hamis felfedezési rátával (FDR). A Ca2+ tranziensek és a viselkedések korrelációjához a rámpás Ca2+ eseményt akkor számoltuk, amikor a ΔF/F értékek 3 standard eltéréssel az alapvonal felett voltak és 2 s-nál hosszabb ideig tartottak. A Ca2+ események számát az első és az utolsó viselkedés között számoltuk, és korreláltuk az adott időszak alatti viselkedési események számával. A korrelációs elemzéshez csak azokat a viselkedési próbákat használtuk fel, amelyekben kettőnél több rögzítés és egynél több visszahívás volt.
A hisztológiai felvételeket ×20-as objektívvel készítettük konfokális mikroszkópon, hacsak másképp nem határoztuk meg. A képeket ImageJ-ben dolgoztuk fel és számoltuk meg egyedi MATLAB-kódokkal. Minden számlálást az állatok nemére vagy vizsgálati állapotára vak kísérleti személyek végeztek. A ChR2 vírusos expressziójának elemzéséhez a ChR2, a c-Fos és a Nissl együttes jelölését a középső injekciós területen kézzel számoltuk. Az Esr1 és a Vglut2, Vgat vagy Galanin együttes jelölésének elemzéséhez öt hasonló helyzetű agyi metszetben öt viszonylag rögzített területet választottunk ki kézi számolásra. Az Esr1-cre állatokban a Cre-expresszió specificitásának vizsgálatához az Esr1 és a Cre együttes jelölését kézzel számoltuk meg az egy állatból nyert több szelet különböző területein. A catFISH-kísérletek ×60-as objektívvel készült képeinek számszerűsítéséhez a citoplazmatikus vagy nukleáris c-Fos és Esr1 pozitív sejteket DAPI ellenfestékkel ismertük fel és kézzel számoltuk meg. Az Esr1+ neuronok vírusos ablációjának hatásának számszerűsítése érdekében az Allen Brain Atlas által meghatározott mPOA-ban az Esr1+ jeleket mindkét oldalon megszámoltuk a Stereo Investigator szoftverrel (MBF bBioscience) végzett elfogulatlan sztereológia segítségével. Konkrétan, egy optikai frakcionáló szonda segítségével az Esr1+ jeleket egy 30×30 μm-es számlálódobozban számoltuk meg egy 100×100 μm-es mintavételi rácson belül. A Vgat+ vagy Vglut2+ neuronok vírusos ablációjának hatásának számszerűsítése érdekében az agyi metszeteket ×10 objektívvel Olympus VS120 segítségével képeztük le. A Vgat+ vagy Vglut2+ jelekkel festett területeket az mPOA-n belül és a szomszédos régiókban MATLAB-kódok segítségével félautomatikusan kivontuk.
Statisztika
A sávdiagramok esetében az adatokat átlag ± s.e.m. A box and whiskers plots esetében az adatokat min-max whiskerekként, az átlagot “+”-val, a mediánt pedig vízszintes vonallal jelöljük. Eltérő rendelkezés hiányában a következő statisztikai teszteket végeztük el, és minden tesztet kétoldalasnak adtunk meg. A kategorikus adatokat a Fisher-féle egzakt teszttel elemeztük. A párosított adatokat párosított teszttel elemeztük. A halmozódási eloszlás statisztikai különbségének elemzésére kétmintás Kolmogorov-Smirnov-tesztet alkalmaztunk. Az egy független változóval rendelkező adatokat egyirányú ANOVA-val elemeztük, amelyet Bonferroni korrekcióval végzett post hoc teszt követett. A két független változóval rendelkező adatokat kétirányú ANOVA-val elemeztük, amelyet Bonferroni korrekcióval végzett post hoc teszt követett. Egyéb összehasonlítások esetén az adatokat az eloszlásra vonatkozóan Lilliefors-féle jó illeszkedés normalitási teszttel vizsgáltuk. Ha az adatok megfeleltek a normalitásvizsgálaton, parametrikus tesztet (Student’s t-teszt) alkalmaztunk. Ellenkező esetben nemparametrikus Wilcoxon rangsorösszeg-tesztet alkalmaztunk. A Pearson-féle korreláció p-értékét és korrelációs együtthatóját a korreláció transzformációjára vonatkozó Student’s t-eloszlás alkalmazásával számították ki. *p < 0,05, **p ≤ 0,01, ***p < 0,001.
Adatok elérhetősége
A tanulmányban szereplő összes adat kérésre rendelkezésre áll.
Kérésre rendelkezésre áll.