Animais
C57BL/6J animais foram comprados do Jackson Laboratory, Slac Laboratory Animal (Shanghai) e criados em casa. Esr1-2a-Cre (Esr1Cre, #017913) e Vglut2-Ires-Cre (Vglut2-Ires-Cre, #012569) foram comprados do Jackson Laboratory. A linha Vgat-Cre (VgatCre) foi gerada anteriormente68. Todas as linhas Cre foram criadas sobre fundo C57BL/6J durante pelo menos uma geração. Os animais foram alojados nas instalações do Instituto de Neurociências em 12 h:12 h de ciclo luz/escuro com alimentos e água ad libitum. Apenas animais heterozigotos dos alelos de Cre Cre Creles foram utilizados no estudo. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Animal Care and Use Committee do Institute of Neuroscience, Academia Chinesa de Ciências, Shanghai, China (IACUC No. NA-016-2016).
Surgery
Ratos adultos de 2-4 meses de idade foram anestesiados com isoflurano (0,8-5%) e colocados em um quadro estereotáxico (David Kopf Instrument, Modelo 1900). Para prevenir a desidratação foi aplicada pomada oftálmica. O crânio foi exposto com uma pequena incisão e foram feitos furos para injetar vírus com pipetas de vidro (15-25 μm de diâmetro na ponta) e para implantar fibras ópticas. As coordenadas para entrega viral no mPOA foram AP, -0,16 mm; ML, ±0,4 mm; DV, -5,150 mm (Paxios e Franklin atlas cerebral de camundongo, 2ª edição). 100-400 nl de vírus foi injetado por lado a um fluxo de 70 nl por minuto usando um injetor caseiro de nanolitro ou a 40 nl por minuto usando uma bomba hidráulica (Harvard Apparatus). As pipetas de vidro foram deixadas no lugar por cerca de ~10 min após a injeção antes da retração. Fibras ópticas mono (diâmetro, 200 μm; N.A., 0,37; comprimento, 6 mm; AniLab Software and Instruments Co., Ltd) ou fibras ópticas duplas (DFC_200/245-0,37_6,0mm_DF0,9_FLT; Doric Lense) foram colocadas 400 μm acima do site de injeção de vírus para experimentos optogenéticos ou 50 μm acima para gravações de fotometria de fibra. As fibras ópticas foram fixadas com cimento dental e parafusos no crânio. Os recém-nascidos foram escolhidos aleatoriamente para serem injetados com o vírus experimental ou de controle. As operações de castração foram realizadas com animais anestesiados com injeção intraperitoneal (i.p.) de cetamina (80 mg kg-1) e xilazina (8 mg kg-1). Os animais tiveram 3-4 semanas de recuperação após as cirurgias antes dos testes comportamentais subsequentes.
Vírus
Avaliações comportamentais
Todos os testes comportamentais foram iniciados pelo menos meia hora após o início do ciclo escuro, e foram registrados usando uma câmera infravermelha a uma taxa de quadros de 25 Hz e pontuados por experimentadores cegos para o genótipo, informação do grupo, ou estado de fotoestimulação dos animais envolvidos. Todos os animais testados para comportamentos, exceto aqueles usados em experimentos de inibição optogenética, eram ratos virgens ingênuos antes do teste. Nos experimentos de inibição optogenética, todos os ratos machos foram alojados com ratos fêmeas e alguns deles se tornaram pais antes do teste, enquanto algumas fêmeas foram alojadas com filhotes, ou acasaladas para se tornarem mães, ou tratadas com semanas de injeção de testosterona antes do teste. Com exceção dos animais usados em experimentos de ativação optogenética, todos os animais foram alojados individualmente 3-7 dias antes dos testes comportamentais.
Para os testes comportamentais de acasalamento, uma fêmea C57BL/6 com ovariectomizado hormonal foi introduzida na gaiola doméstica e filmada por 30 min. Os testes de comportamento de acasalamento foram repetidos três vezes com diferentes animais de estimulação com pelo menos três dias de intervalo. O comportamento dos pais foi testado espalhando três filhotes de idade entre P1 e P4 na extremidade afastada do ninho e filmando o animal por ~15 min e foram repetidos 2-3 vezes. A agressão territorial foi testada através da introdução de um rato intruso de Balb/c, comprado da Slac Laboratory Animal (Shanghai), na gaiola do animal testado e gravação de vídeo por ~15 min.
Videos foram anotados manualmente, quadro a quadro, usando um programa MATLAB personalizado, como descrito anteriormente8. Os comportamentos foram pontuados de acordo com os seguintes critérios: os contatos nose-to-face, nose-to-body, ou nose-to-urogenital iniciados pelos animais testados são pontuados coletivamente como “investigação social”, dos quais o contato nose-to-urogenital é especificamente definido como “quimioinvestigação”, também conhecido como “sniff”. O “Monte” é pontuado quando o animal experimental coloca seus membros anteriores na parte de trás do estímulo, sobe no topo e move a pélvis. Os movimentos pélvicos rítmicos após a montagem são pontuados como “Impulso pélvico”. Ações iniciadas pelo residente em direção a um intruso macho, incluindo lunges, mordidas, tombos, são pontuadas como “Ataque”. “Contacto com cachorro” é pontuado quando um animal contacta um cachorro com o nariz ou a boca. A “recuperação do cachorro” é pontuada quando um animal segura o cachorro com a boca e viaja, geralmente em direcção ao ninho. O “agachamento” é pontuado quando o animal se agacha com as costas e paira sobre os cachorros no ninho. Os cachorros são sempre inspecionados após um teste de comportamento para possíveis ferimentos. Cerca de 2% dos testes comportamentais resultaram em filhotes feridos. A exclusão dessas experiências não influenciou em nenhuma conclusão.
Ativação optogenética
Animais usados para experimentos optogenéticos foram alojados em grupo. No dia do teste comportamental, eles foram introduzidos a uma nova gaiola. Uma fibra óptica externa foi usada para conectar uma fonte de energia laser de 473 nm (Shanghai Laser and Optics Century Co. ou Changchun New Industries Optoelectronics Tech Co., Ltd.) à fibra óptica implantada no animal. A fibra óptica externa foi ligada a uma junta rotativa (FRJ_1 × 1_FC_FC, Doric Lense) para permitir que o animal se comportasse livremente. O animal testado foi autorizado a explorar a gaiola durante ~15 min com a fibra externa ligada. Posteriormente, um programa MATLAB personalizado foi iniciado para controlar um Master 9 (A.M.P.I.), que enviou um gatilho para iniciar a gravação da câmera e sinais para o laser para entregar 15 s de fotoestimulação a 40 Hz 12 mW ou 20 Hz 5 mW, espaçados 90-120 s ao acaso. A potência do laser foi ajustada para cada animal de acordo com a eficiência de transitividade da luminância da fibra óptica implantada, medida antes da implantação, para garantir a potência da luz emitida na ponta da fibra. Durante a estimulação laser, os animais foram testados isoladamente para locomoção, ou com uma fêmea com ovariectomizado hormonal, um macho C57BL/6, um rato jovem de idade P13-P15, filhotes de idade P1-P4, ou blocos de borracha de tamanho semelhante ao estímulo. Cinco-doze estímulos foram dados durante cada ensaio. Um-quatro ensaios com cada estímulo (3-5 minutos de intervalo) foram realizados em qualquer dia para cada animal. Após a conclusão de todos os testes comportamentais, os animais receberam trens de fotoestimulação (15 s, 12 mW, 40 Hz, 10 vezes, um intervalo fixo de 105 s) e perfundidos transcardialmente com paraformaldeído a 4% uma hora após a estimulação luminosa para análise histológica. O sangue também foi coletado no momento da morte para medidas hormonais.
Fotometria de fibra
Animais usados para experimentos de fotometria de fibra foram alojados individualmente 3-7 dias antes dos testes comportamentais. Durante o dia do teste, a fibra óptica implantada foi conectada ao escopo F (Biolink Optics Technology Inc., Beijing), uma instalação integrada de gravação de fotometria de fibra óptica, através de uma fibra óptica externa. No F-scope, um laser de excitação de 488 nm (OBIS 488LS; Coherent) é refletido de um espelho dicróico (MD498, Thorlabs). Os sinais de emissão recolhidos através da fibra óptica implantada são filtrados com um filtro passa-banda (MF525-39, Thorlabs) e direccionados para um tubo fotomultiplicador (PMT, R3896, Hamamatsu). Durante as gravações, a potência do laser foi ajustada para cada animal de acordo com a eficiência de transitividade da luminância da fibra óptica implantada para assegurar que a luz emitida na ponta da fibra era de ~30 μw e o ganho de tensão do PMT foi ajustado para 500 v para animais GCamp6s e 300-350 v para animais de controle. Uma vez iniciado, o software F-scope enviou um sinal de disparo para iniciar a gravação de vídeo a partir da câmera infravermelha. Os sinais de emissão foram filtrados a 30 Hz e amostrados a 500 Hz com uma placa de aquisição de dados (USB6009, National Instrument) usando um software fornecido pela Biolink Optics. Para uma determinada experiência, os animais foram primeiro autorizados a explorar durante ~5 min, durante os quais os sinais de linha de base foram gravados. Em seguida, um estímulo como uma fêmea com ovariectomia hormonal, um falso brinquedo de plástico de rato, filhotes de idade de P1-P4 ou blocos de borracha de tamanho semelhante de filhotes foram introduzidos. Os animais puderam interagir e comportar-se com os estímulos durante 15-90 min antes da remoção dos estímulos, após o que foram registrados sinais para outros ~5 min.
Inibição optogenética
Animais utilizados para experimentos de inibição optogenética foram alojados individualmente. Ratos machos foram alojados com fêmeas para serem sexualmente experimentados ou para se tornarem pais antes dos testes. Ratos fêmeas virgens foram testados como animais ingênuos para o acasalamento entre machos e tipicos e para comportamentos maternos. Em casos de comportamentos maternos de base pobre durante o teste inicial, eles foram alojados com filhotes durante a noite e testados novamente para comportamentos maternos. Após o teste de comportamento materno, algumas fêmeas foram tratadas dia sim, dia não, com injeção subcutânea de testosterona (100 μg em 50 μl sunflower oil, Shanghai Pharm.) por cerca de 3 semanas antes de serem testadas novamente para acasalamento macho-tipico. As fêmeas testadas como mães foram acasaladas após a injeção viral para produzir seus próprios filhotes.
Antes do teste comportamental, um cordão de dupla fibra óptica (DFP_200/230/900-0.37_1m_DF0.9_2FCM, Doric Lense) foi usado para conectar uma fonte de energia laser de 473 nm (Shanghai Laser and Optics Century Co. ou Changchun New Industries Optoelectronics Tech Co., Ltd.) à fibra óptica dupla implantada (DFC_200/245-0.37_6.0mm_DF0.9_FLT, Doric Lense) no animal através de uma junta rotativa (FRJ 1 × 2i FC-2FC 0.22, Doric Lense) para permitir que o animal se comportasse livremente. Após ~10 min de habitação, a câmera foi acionada para gravar o processo comportamental por um sinal enviado pelo Mestre 9, que foi controlado por um programa MATLAB personalizado escrito. Para emitir luz após a aproximação, a luz (~12 mW) foi acionada automaticamente para ser emitida continuamente desde que as posições do animal testado fossem detectadas pelo programa para estar dentro do comprimento de um corpo para a fêmea primada hormonal ovariectomizada nos testes de comportamento de acasalamento ou dentro da região da cria, que foi definida marcando uma área ligeiramente maior ao redor de cada cria dispersa nos testes de comportamento materno. Pelo menos dois testes de luz e dois testes sem luz foram realizados alternadamente para cada teste. Para emitir luzes após o início dos comportamentos definidos, a luz azul (~12 mW) de comprimento fixo (5 ou 10 s) foi acionada manualmente quando o experimentador observou o comportamento dos interesses em tempo real. Um ou dois testes de luz foram realizados alternativamente para cada teste.
Imunoescentes fluorescentes
Animais foram anestesiados com 10% de hidrato de cloral e perfundidos transardialmente com PBS seguido por paraformaldeído gelado a 4% (PFA) em PBS. Posteriormente, os cérebros foram seccionados em 40 μm com um vibratoma (VT1000S, Leica). As seções foram divididas igualmente em vários conjuntos e processadas para coloração ou montadas diretamente. As secções cerebrais foram bloqueadas em soro de cabra a 5% em AT (0,1% Triton e 2 mM MgCl2 em PBS) durante 1 h à temperatura ambiente e incubadas durante a noite a 4 °C em AGT (0,5% soro de cabra normal, 0.1% Triton e 2 mM MgCl2 em PBS) contendo anticorpos primários apropriados (coelho anti-c-Fos, 1:2000, Santa Cruz, Cat# sc-52; coelho anti-Esr154, 1:10.000, Millipore, Cat# 06-935). No dia seguinte, as secções cerebrais foram lavadas com AGT durante três vezes (30 min cada) e incubadas com anticorpos secundários apropriados (Alexa Fluor 488 conjugado, 1:1000; Cy3 conjugado, 1:1000, Jackson ImmunoResearch) à temperatura ambiente durante 2 h. As secções cerebrais foram contrabalançadas com NeuroTrace (Life Technologies, Cat# N21479, 1:300) ou DAPI (5 mg ml-1, 1:1000, Sigma) em AT. Após várias lavagens em AGT, AT e PBS, cortes cerebrais foram montados em lâminas de vidro.
ADAB coloração
Seções cerebrais foram preparadas de forma semelhante aos experimentos de imuno coloração fluorescente e foram pré-tratadas com 3% H2O2 por 30 min à temperatura ambiente para bloquear a peroxidase endógena, lavadas duas vezes por 10 min cada em PBST (0.3% Triton X-100 em PBS), bloqueados com soro de cabra a 5% em PBST durante 2 h à temperatura ambiente, e incubados com anticorpo primário anti-c-Fos (Coelho anti-c-fos, 1:2000, Santa Cruz, Cat# sc-52) em PBST durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, as secções foram lavadas seis vezes em PBST, 10 min cada, e depois incubadas com o anticorpo secundário biotino-conjugado de cabra anti-coelho (Cat#111-065-003, Jackson ImmunoResearch) em PBST durante 2 h à temperatura ambiente. Após três lavagens em PBS, 5 min cada, foram coradas secções cerebrais com VECTASTAIN® ABC Reagent durante 30 min seguindo o manual do fabricante. Após duas lavagens de 5 minutos em PBS, os cortes cerebrais foram incubados em solução de 3,3-diaminobenzidina (Cat# D5637-5G, Sigma) com intensificação do níquel até atingir a intensidade de coloração desejada. A reação foi interrompida com a lavagem dos cortes em água da torneira. Os cortes cerebrais foram montados em lâminas de vidro e capturados sob objetivas ×4 ou ×10 com microscópios de luz convencionais.
Hibridação in situ
DNA templates para geração de sondas in situ foram clonados utilizando os seguintes conjuntos de primer para cada gene correspondente: Vgat, 5′-gccattcagggcatgttc-3′ e 5′-agcagcagcgtgaagaccacc-3′; Vglut2, 5′-atcgactagtccaaaatcttactactaggtgctc-3′ e 5′-atcgctcgagtagccatccatctgttcctgttccact-3′; Cre, 5′- ccaatttactgaccgaccacca-3′ e 5′-tatttactacattggtccagccagccacca-3′; GAD1, 5′-cattgaggagatagagaggttgttg-3′ e 5′-agagaagagcgaaggctact-3′; Galanin, 5′-atcctgcactgaccagccagcc-3′ e 5′-ttggcttgaggaggttggc-3′. As sondas de RNA anti-senso foram transcritas com RNA polimerase T7 (Promega, Cat# P207E) e nucleotídeos marcados com digoxigenina (DIG). Os animais foram anestesiados com 10% de hidrato de cloral e perfundidos transardialmente com PBS tratada com DEPC (D-PBS) seguida de paraformaldeído gelado a 4% (PFA) em D-PBS. Posteriormente, os cérebros foram seccionados em 40 μm usando um vibratoma (VT1000S, Leica). Os cortes cerebrais foram lavados em tampão 2XSSC contendo 0,1% de triton durante 30 min, acetilados em trietanolamina 0,1 M (pH 8,0) com anidrido acético 0,25% (vol/vol) durante 10 min, equilibrados em solução de pré-hibridação durante 2 h a 65 ℃ e posteriormente incubados com sondas específicas de RNA 0,5 μg ml-1 em tampão de hibridação durante a noite a 65 ℃. No dia seguinte, as secções foram lavadas em solução de pré-hibridação e pré-hibridação/TBST (TBS com 0,1% tween-20) durante 30 min cada. Em seguida, as secções foram lavadas com TBST por duas vezes e TAE por três vezes, cada uma delas durante 5 min. As secções foram então transferidas para poços em gel de agarose a 2%, que foram executados em 1XTAE a 60 V durante 2 h para remover as sondas não-hibridizadas. As secções foram então lavadas duas vezes em TBST, e subsequentemente incubadas com carneiros anti-digoxigenina -AP (1:2000, Roche, Cat# 11093274910), por vezes juntamente com anticorpos anti-Esr1 de coelho (1:3000, Millipore, Cat# 06-935) para efeitos de co-coloração, em reagente de bloqueio a 0,5% (Roche, 11096176001) a 4 °C durante a noite. No segundo dia, para as secções de coloração de campo brilhante foram lavadas e coradas com NBT (Roche, Cat# 11383213001) e BCIP (Roche, Cat# 11383221001) durante 4-10 h a 37 ℃. Para hibridação fluorescente in situ combinada com imunohistoquímica, os cortes foram corados primeiro com anticorpos secundários fluorescentes, seguidos de coloração com vermelho rápido (HNPP Fluorescent Detection Set, Roche, Cat# 11758888001) e contra coloração com DAPI (5 mg ml-1, 1:1000, Sigma) em PBS. Todas as secções foram lavadas após a coloração e montadas em lâminas de vidro. As imagens foram capturadas com objetiva ×20 usando um microscópio convencional ou confocal.
catFISH
A maioria dos animais utilizados no experimento catFish foram experimentados. Para o procedimento, foram permitidos aos animais dois episódios de 5 minutos de interações sociais com uma fêmea com ovariectomizado hormonal ou filhotes dispersos, separados por 30 minutos. Imediatamente após o segundo episódio, os animais foram anestesiados com 10% de hidrato de cloral e perfundidos transcardialmente com DEPC-PBS seguido de PFA gelado a 4% em PBS. O cérebro foi dissecado e pós-fixado durante a noite a 4°C e desidratado com 30% de sacarose em DPEC-PBS. Posteriormente, os cérebros foram seccionados na espessura de 20 μm e montados nas lâminas de SuperFrost Plus® (Fisher Scientific, Cat. No. 12-550-15). Após secagem no ar, as lâminas foram armazenadas em -80 °C antes de serem processadas de acordo com o RNAscope® Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 User Manual (ACD Bio.). Sondas contra c-Fos intron, c-Fos mRNA, e Esr1 foram encomendadas ao ACD Bio. e usadas no experimento. As imagens foram capturadas sob uma objetiva ×60 usando um microscópio confocal.
Registros eletrofisiológicos
C57BL/6 animais injetados com AAV codificando ChR2-mCherry no mPOA ou Esr1Cre ratos injetados com AAV codificando GtACR1 foram anestesiados com isoflurano e transardialmente perfurados com solução de alta sacarose oxigenada gelada (95% O2/5% CO2) (composição em mM: 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 2 Na2HPO4, 2 MgSO4, 213 sacarose, 26 NaHCO3). Após dissecção do cérebro, cortes coronais incluindo o mPOA foram cortados em 250 μm usando um vibratoma (VT-1200S, Leica) em solução de corte oxigenada gelada. As fatias cerebrais foram então incubadas em líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF; composição em mM: 126 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1,25 Na2HPO4, 2 MgSO4, 10 glucose, 26 NaHCO3, 2 CaCl2) a 34 °C durante pelo menos 1 h e registradas à temperatura ambiente. As células foram identificadas sob microscópio fluorescente e visualizadas por contraste de interferência diferencial de infravermelho (BX51, Olympus). As gravações de pinças de corrente de células inteiras foram realizadas com um amplificador MultiClamp700B e interface Digidata 1440A (Dispositivos Moleculares). O eletrodo patch-clamp (5-8 MΩ) foi preenchido com uma solução intracelular (composição em mM: 120 K-gluconato, 4 KCl, 10 HEPES, 10 fosfocritina de sódio, 4 Mg-ATP, e 0,3 Na3-GTP, pH:7,3, 265 mOsm). Para ativação optogenética, a luz azul (473 nm, 10 ms de largura, 14 mw mm-2, 40 pulsos) foi entregue em fatias através de objetiva ×40 usando uma fonte de luz LED X-Cite (Lumen Dynamics). A fidelidade do pico em neurônios ChR2-expressores foi medida pela contagem do número de pulsos de luz que evocaram com sucesso os potenciais de ação em diferentes freqüências. A fidelidade dos picos foi calculada através de cinco estimulações e traçada. Para a inibição optogenética, o potencial de ação dos neurônios GtACR1-expressores foi induzido pela retenção do potencial de membrana -48 mW com uma injeção de corrente e luz azul contínua repetida foi fornecida em fatias.
Calcium imaging in brain slices
AAVs codificando ChR2 e AAVs codificando GCamp6s, ambos impulsionados por hSyn, foram co-injetados no mPOA dos animais C57BL/6. Foram preparadas fatias cerebrais agudas, incluindo o mPOA, semelhantes aos procedimentos eletrofisiológicos descritos acima. A imagem do cálcio foi realizada usando dois microscópio de varredura a laser de fótons (Ultima, Prairie Instruments Inc.) com uma objetiva de imersão de água 20X/0,95-NA XLUMPLFL (Olympus). O laser Ti:safira foi ajustado para 940 nm, e imagens de tamanho de 512 × 512 pixels foram adquiridas através de filtro de emissão de 525/70 nm à taxa de quadros de 1,2 Hz. Trens aleatórios de luz de 470 nm (pulso de 10ms, 15 s, 8,4 mW mm-2) de diferentes freqüências (10 Hz, 20 Hz, 40 Hz) foram entregues às fatias com intervalos de ~2 min. As imagens foram analisadas usando ImageJ.
ensaios hormonais
Sangue de tronco foi coletado no momento da matança antes da perfusão. O soro foi preparado. Os títulos hormonais foram testados usando um kit ELISA de testosterona (DRG Instruments GmbH, Alemanha, Divisão da ARG international, Inc, Cat# EIA-1559) de acordo com os protocolos do fabricante.
Análise de dados
Todos os códigos foram escritos em MATLAB e usados para análise de dados, e estão disponíveis mediante solicitação. Nenhum cálculo de tamanho de amostra foi realizado. O número de células registradas em fatias ou contadas na coloração e o número de animais utilizados para testes comportamentais e coloração foram escolhidos de acordo com a literatura publicada de experimentos similares. Foram excluídos da análise os pontos de dados de animais que, na análise histológica pós-hoc, foram considerados como acertos errôneos de acordo com critérios pré-estabelecidos. No total, três ratos Esr1Cre fêmeas e um rato Esr1Cre macho injectado com GtACR1, um VgatCre macho e fêmea e um rato Esr1Cre fêmea injectado com Casp3 foram excluídos da análise.
Para analisar os dados dos experimentos de imagem Ca2+ em fatias de cérebro, as imagens foram quantificadas em ImageJ. Em resumo, as células GCaMP6s+ foram delineadas manualmente e as mudanças relativas de fluorescência (ΔF/F) foram calculadas para cada célula com a equação ΔF/F = (F-F0)/F0, em que F0 é a intensidade média de pixels nos últimos 10 quadros antes da fotoestimulação e F é a intensidade média de pixels nos primeiros 6 quadros após a fotoestimulação. As imagens adquiridas durante os períodos de foto-estimulação foram excluídas da análise. Uma célula ativada foi definida operacionalmente como células mostrando aumento em ΔF/F que estava a 5 desvios padrão dos valores médios de ΔF/F medidos em 30 quadros antes da primeira fotoestimulação.
Para analisar a locomoção com desvio da luz, os traços de movimento foram primeiro extraídos usando códigos MATLAB personalizados, que reconhecem o centróide de um animal. A velocidade do movimento foi então calculada em 1 s de caixas de tempo, medindo a distância percorrida. Os 15 pontos de dados de velocidade de movimento durante um período de fotoestimulação foram comparados com os 15 pontos anteriores para testar se aquela estimulação luminosa induziu o aumento da velocidade naquela experiência. Ao nível do animal, as médias das velocidades de movimento durante cada período de fotoestimulação foram comparadas com as médias das velocidades de movimento imediatamente antes de cada período de fotoestimulação para determinar se a locomoção induzida pela luz aumenta naquele animal. Para montagem e recuperação de filhotes induzidos por optogenética, os vídeos foram primeiramente pontuados cegamente. Os registros de vídeo foram então alinhados aos registros de fotoestimulação para extrair a porcentagem do experimento, a latência de início e a duração total dos comportamentos evocados. Apenas os comportamentos que ocorreram durante a estimulação luminosa foram contados como comportamentos optogeneticamente induzidos. Se um comportamento ocorreu antes, mas mesmo assim entrou em um período de fotoestimulação, tal comportamento não foi contado como comportamentos optogeneticamente induzidos. Os parâmetros foram sempre calculados como média entre períodos de fotoestimulação no mesmo estudo comportamental e depois entre estudos se houvesse múltiplos. Para traçar a distribuição temporal dos comportamentos evocados optogeneticamente, apenas os períodos de fotoestimulação nos quais os comportamentos ocorreram foram usados para fazer a média. Em testes comportamentais com um macho, um rato jovem ou filhotes falsos foram usados como estímulo ou quando animais ChR2 foram castrados, comportamentos induzidos optogeneticamente foram comparados com comportamentos espontâneos que ocorreram no período de 15 s imediatamente anterior aos períodos de fotoestimulação.
Para analisar o efeito da inibição optogeneticamente em comportamentos específicos, os vídeos foram primeiramente pontuados cegamente. Os vídeos foram então alinhados aos logs de fotoestimulação para extrair eventos de comportamento que encontraram estimulação luminosa. Para traçar vários parâmetros de comportamentos específicos, os eventos comportamentais que encontraram estímulo luminoso foram calculados como média no nível do ensaio se existissem múltiplos ensaios e depois no nível animal. Para traçar a distribuição de acumulação de comportamentos específicos, apenas os eventos comportamentais que encontraram estimulação luminosa foram analisados.
Para simular um centro de ativação para um animal ChR2, uma área 1100×1500 μm com um lado próximo à linha média e o lado perpendicular próximo à base do cérebro foi cortado de cada seção coronal do cérebro e foi redimensionado para 1 μm por pixel. Os sinais c-Fos em cada 100×100 μm foram extraídos semi-automáticos usando o programa MATLAB juntamente com o ImageJ e somados em uma matriz de 11 × 15 de acordo com a sua localização dentro de cada seção. O número médio de células NeuN/HuCD+ dentro de um quadrado de 100 μm2 foi estimado em ~25. Para calcular as coordenadas do centro de ativação ao longo do eixo lateral-medial e dorsal-ventral, os números dentro da matriz 11 × 15 foram calculados como média através de uma série de seções cerebrais que se estenderam anterior e posteriormente para cada animal e se ajustaram com a função bidimensional gaussiana em MATLAB. Para calcular a coordenada anterior-posterior do centro de ativação, o número total de c-Fos foi somado para cada seção cerebral e ajustado com uma única função gaussiana.
Para experimentos de fotometria de fibra, os sinais de fluorescência bruta foram ajustados ainda mais de acordo com a tendência geral para contabilizar o clareamento fotográfico. Testes com jitter, ondas quadradas de sinais ou de relação sinal/ruído extremamente baixa foram excluídos de análises posteriores. Para a resposta inicial, os valores de mudança de fluorescência (ΔF/F) foram derivados calculando (F-F0)/F0, onde F0 é a mediana do sinal de fluorescência de linha de base. Para os sinais de fluorescência alinhados com os comportamentos, os dados foram segmentados com base em eventos comportamentais dentro de ensaios individuais e os sinais médios 10-15 s antes do início do comportamento foram usados como F0. Para analisar a significância estatística dos dois sinais de fluorescência relacionados a eventos, foi utilizado o teste t com taxa de falsa descoberta (FDR) de 0,05. Para correlacionar Ca2+ transientes e comportamentos, um evento de Ca2+ em rampa foi contado quando os valores de ΔF/F foram 3 desvios padrão acima da linha de base e duraram mais de 2 s. Os números de eventos de Ca2+ foram contados entre o primeiro e o último comportamento e correlacionados com os números de eventos comportamentais durante esse período. Somente testes comportamentais que tiveram mais de duas montagens e mais de uma recuperação foram usados para análise de correlação.
Imagens histológicas foram capturadas com objetiva ×20 em um microscópio confocal, a menos que especificado de outra forma. As imagens foram processadas e contadas no ImageJ com códigos MATLAB personalizados. Todas as contagens foram feitas por experimentadores cegos para o sexo ou para a condição de teste do animal. Para analisar a expressão viral do ChR2, a co-rotulagem do ChR2, c-Fos e Nissl na área de injeção central foi contada manualmente. Para analisar a co-rotulagem de Esr1 e Vglut2, Vgat ou Galanin, cinco áreas relativamente fixas em cinco seções cerebrais de posições similares foram selecionadas para contar manualmente. Para testar a especificidade da expressão Cre em animais Esr1-cre, a co-rotulagem de Esr1 e Cre foi contada manualmente em várias áreas de múltiplas fatias obtidas de um animal. Para quantificar as imagens dos experimentos catFISH, que foram realizadas sob uma objetiva ×60, células positivas para citoplasmáticas ou nucleares c-Fos e para Esr1 foram reconhecidas com DAPI como a contra-rotulagem e contadas manualmente. Para quantificar os efeitos da ablação viral dos neurônios Esr1+, os sinais Esr1+ no mPOA, conforme definido pelo Atlas Allen Brain Brain, foram contados para ambos os lados usando a estereologia imparcial com o software Stereo Investigator (MBF bBioscience). Especificamente, usando uma sonda fracionadora óptica, os sinais Esr1+ foram numerados em uma caixa de contagem 30×30 μm dentro de uma grade de amostragem 100×100 μm. Para quantificar os efeitos da ablação viral dos neurônios Vgat+ ou Vglut2+, foram feitas imagens de cortes cerebrais com objetiva ×10 via Olympus VS120. Áreas coradas com sinais Vgat+ ou Vglut2+ dentro do mPOA e regiões adjacentes foram extraídas semi-automaticamente usando códigos MATLAB.
Estatistics
Para gráficos de barras, os dados são apresentados como média ± s.e.m. Em gráficos de caixa e bigodes, os dados são apresentados como min a max bigodes e a média indicada por “+” e a mediana indicada por uma linha horizontal. Salvo indicação em contrário, foram realizados os seguintes testes estatísticos e todos os testes foram especificados em duas faces. Os dados categóricos foram analisados pelo teste exato de Fisher. Os dados emparelhados foram analisados por teste emparelhado. Para analisar a diferença estatística da distribuição da acumulação, foi utilizado o teste de Kolmogorov-Smirnov de duas amostras. Os dados com uma variável independente foram analisados por ANOVAs unidirecionais seguidos por teste pós-hoc com correção de Bonferroni. Os dados com duas variáveis independentes foram analisados por ANOVAs bidirecionais seguidos pelo teste pós-hoc com correção de Bonferroni. Para outras comparações, os dados foram testados para a distribuição com o teste de normalidade de Lilliefors. Caso os dados passassem no teste de normalidade, foi utilizado o teste paramétrico (teste t de Student). Caso contrário, foi utilizado o teste não paramétrico de Wilcoxon rank sum. O valor de p e o coeficiente de correlação para a correlação de Pearson foram calculados usando uma distribuição t de Student para uma transformação da correlação. *p < 0.05, **p ≤ 0.01, ***p < 0.001.
Dados disponíveis
Todos os dados deste estudo estão disponíveis mediante solicitação.