Le analisi di co-immunoprecipitazione in tempo reale su singola molecola rivelano dinamiche di segnalazione Ras specifiche per il cancro

Immagini in tempo reale di co-IP su singola molecola

Prima dimostriamo che la cinetica di un’interazione proteina-proteina può essere misurata in estratti di cellule a livello di singola molecola (Fig. 1). Come interazione modello in una via di segnalazione cellulare, abbiamo scelto l’interazione tra Ras e Raf, che è il passo iniziale della via MAPK conservato che è iper-attivato in molti tumori umani 5,6,7. Abbiamo usato il dominio Ras-binding di cRaf (cRafRBD) e una versione di HRas contenente una mutazione a punto singolo, Q61L, che lo rende costitutivamente attivo6,8,9,10,11,12. Live cell imaging di cellule HeLa co-esprimere queste due proteine ha mostrato un alto livello di co-localizzazione (Fig. 1a e Fig. supplementare S2). Siamo stati in grado di dirigere questa co-localizzazione con rapamicina-triggered traslocazione di HRas alla membrana plasmatica 13, che ha portato alla localizzazione concomitante di cRafRBD agli stessi punti. Il convenzionale co-IP anche prodotto una banda occidentale chiaro, indicando una selettiva interazione proteina-proteina tra HRas costitutivamente attivo e cRafRBD (Fig. 1b, a sinistra). Tuttavia, abbiamo scoperto che questa banda proteica apparentemente chiaro conteneva solo meno del 5% delle proteine intera preda, suggerendo che le proteine preda potrebbe non essere stabilmente legato alle esche, ma rimosso alla porzione flow-through attraverso processi di lavaggio (Fig. 1b, destra e Supplementary Fig. S3). Notiamo inoltre che entrambi gli approcci di imaging delle cellule vive e co-IP non può sezionare la cinetica reale di questo forse debole, transitorio interazione proteina-proteina.

(a) cella viva co-localizzazione studio per l’interazione HRas-cRafRBD. Le interazioni proteina-proteina tra HRas e cRafRBD sono state valutate osservando la traslocazione di cRafRBD alla membrana plasmatica insieme a HRas. CA e DN indicano le forme costitutivamente attive e dominanti negative di HRas, rispettivamente. Barra della scala, 10 μm. (b) convenzionale co-IP dati per l’interazione HRas-cRafRBD. Per le analisi co-IP, GST-cRafRBD (a sinistra) e mCherry-HRas proteine (a destra) sono stati utilizzati, rispettivamente, come le esche immobilizzati su perline. (C) Schema del real-time singola molecola co-IP. (D) immagine TIRF di mCherry-HRas immobilizzato sulla superficie. Barra della scala, 10 μm. (E) fotogrammi successivi da imaging in tempo reale di singola molecola co-IP. La traccia in tempo reale di questi eventi di legame è mostrato in f e contrassegnati con un quadrato rosso. Barra della scala, 1 micron. (F,G) Esempi di tracce in tempo reale dal real-time single-molecola co-IP imaging. Il segnale consiste principalmente di una diffusa fluorescenza di fondo sovrapposta ad una sequenza di picchi di fluorescenza. (h) Un esperimento di controllo negativo con superficie-immobilizzato DN HRas (S17N). (i) Distribuzione kbind per l’esperimento in f. Tassi cinetici rilevanti sono stati determinati utilizzando un singolo esponenziale curva fit (linee solide). (J) Un secondo esperimento di controllo negativo con superficie-immobilizzato FLAG-eGFP. (K) Distribuzione di kdiss per l’esperimento in f. E kblinking per l’esperimento in j. Tassi cinetici rilevanti sono stati determinati utilizzando un singolo esponenziale curva di adattamento (linee continue). Le barre di errore denotano l’errore standard (s.e.; n>200).

Per visualizzare l’interazione HRas-cRafRBD in tempo reale a livello di singola molecola, abbiamo fuso il gene HRas con la proteina rossa fluorescente mCherry e abbiamo fuso cRafRBD con proteina fluorescente verde potenziata (eGFP; Fig. 1c). Abbiamo espresso ogni proteina in un gruppo separato di cellule HEK293. Abbiamo usato la strategia di singola molecola pull-down per immobilizzare mCherry-HRas sulla superficie2,3 (Fig. 1c). Abbiamo poi iniettato il secondo lisato di cellule intere contenente eGFP-cRafRBD sulla superficie mCherry-HRas immobilizzato come in un convenzionale co-IP (Fig. 1c). Abbiamo usato un microscopio a riflessione interna totale (TIR) per generare un campo elettrico evanescente che selettivamente eccitato eGFP-cRafRBDs che è venuto entro 100 nm della superficie. Per osservare deboli interazioni proteina-proteina, singoli arrivi eGFP-cRafRBD alla superficie sono stati monitorati in tempo reale con il secondo lisato di cellule intere mantenuto nella camera (Fig. 1c).

Figura 1f mostra una tipica traccia in tempo reale di questa singola molecola co-IP preparazione. Ogni traccia è stata prodotta integrando il segnale di fluorescenza su una regione circolare di interesse (ROI) con una superficie di 1.1 μm2 (Fig. 1e). Abbiamo controllato la densità di superficie di mCherry-HRas per mantenere una media di 0,5 molecola HRas per ROI (Fig. supplementare S4). Abbiamo anche usato il filtraggio gaussiano durante l’integrazione del segnale e una soglia rigorosa per la rilevazione del segnale per garantire che le tracce in tempo reale riportato gli eventi di legame di singole proteine HRas (Fig. 1g e Fig. supplementare S5). Ogni traccia in tempo reale è chiaramente costituito da due parti: una fluorescenza di fondo e singoli picchi di fluorescenza. Ogni molecola eGFP-cRafRBD, in movimento secondo il moto browniano, dovrebbe spendere meno di 50 μs per visita allo strato di eccitazione TIR. Come 50 μs è tre ordini di grandezza inferiore alla risoluzione temporale del nostro apparato di imaging (50 ms), il movimento browniano di molte molecole eGFP-cRafRBD produrre un livello costante per la fluorescenza di fondo. I singoli picchi di fluorescenza, d’altra parte, indicano che un singolo eGFP-cRafRBD ha interagito con una molecola sulla superficie abbastanza a lungo per sopravvivere l’integrazione del segnale 50 ms.

Abbiamo poi analizzato la cinetica essenziale di questa interazione proteina-proteina analizzando τoff, il tempo tra eventi di legame, e τon, la durata di un singolo evento di legame (Fig. 1g). Fitting singole equazioni esponenziali alle distribuzioni τoff e τon dà i tassi cinetici di kbind e kdiss, rispettivamente. Per garantire che i picchi di fluorescenza sono davvero il risultato di una specifica interazione HRas-cRafRBD, abbiamo eseguito la stessa eGFP-cRafRBD legame esperimento con superficie-immobilizzato HRas dominante negativo (S17N), che ha una ridotta affinità al GTP 14,15. Con la forma dominante negativa, la frequenza del picco di fluorescenza (kbind) è stato seriamente diminuito (Fig. 1h). Questo controllo negativo dimostra che i picchi di fluorescenza non sono né artefatti di semplice eGFP-cRafRBD superficie adsorbimento né sono dovuti alla superficie immobilizzazione di altre proteine con interazioni eGFP-cRafRBD spurie. Invece, queste tracce di spike di fluorescenza riportano fedelmente gli eventi di legame HRas-cRafRBD.

E ‘anche notevole che la durata di un singolo evento di legame dura in genere solo poche centinaia di ms (Fig. 1f). Abbiamo studiato la dinamica di blinking di FLAG-eGFP16 immobilizzato su una superficie con un anticorpo anti-FLAG (Fig. 1j). Foto-lampeggiamento di FLAG-eGFP avviene in media ogni pochi secondi, dando un tasso cinetico inferiore a 0,3 s-1, e questo tasso eGFP photoblinking è un ordine di grandezza più lento del kdiss abbiamo misurato (Fig. 1k). Inoltre, abbiamo convalidato tutte le singole molecole tassi cinetici di kbind e kdiss utilizzando un criterio di co-localizzazione che ha richiesto co-localizzazione dei segnali di fluorescenza dal mCherry-HRas e eGFP-cRafRBD proteine (Supplementary Fig. S6). Così, l’interazione HRas-cRafRBD deve effettivamente avere un rapido turnover, poche volte al secondo11,12.

Visualizzazione dei complessi di incontro nell’interazione Ras-Raf

L’analisi dettagliata della frequenza di legame HRas-cRafRBD (kbind) indica l’esistenza di veloci complessi di incontro pre-equilibrante 17,18,19,20,21, che sono sciolti intermedi di interazione proteina-proteina che dovrebbe essere popolato prima della formazione del complesso finale HRas-cRafRBD (Fig. 2). Quando abbiamo aumentato la concentrazione di eGFP-cRafRBD da 5 a 50 nM, il kbind ha mostrato un aumento parabolico (Fig. 2a), che può essere meglio adattato all’equazione di con un coefficiente di Hill (n) di 1,1 (22,23), una costante di dissociazione (K1) di 43 nM per la formazione del complesso incontro, e un κon di 2.16 s-1 nM-1, che è il tasso cinetico di formazione dello stato finale legato da un complesso di incontro (metodi supplementari e Fig. supplementare S7). kdiss, d’altra parte, è in gran parte costante per le concentrazioni eGFP-cRafRBD abbiamo studiato (Fig. 2b). Questi tassi cinetici misurati con il nostro real-time singola molecola co-IP sono strettamente coerenti con i rapporti precedenti utilizzando saggi biochimici di massa (Tabella supplementare S1). Una nota è che abbiamo assunto una conformazione predominante per il complesso finale HRas-cRafRBD. Anche se la nostra ipotesi è corroborata dalle distribuzioni unimodali dell’intensità dei picchi di fluorescenza (Fig. S8 supplementare), non possiamo escludere completamente la possibilità che ci sono conformazioni multiple per il complesso HRas-cRafRBD con percorsi multipli che portano a loro.

(a) kbind in funzione della concentrazione di cRafRBD. Un aumento lineare di kbind è mostrato come confronto. (b) kdiss in funzione della concentrazione di cRafRBD. kblinking dall’esperimento in Fig. 1j è mostrato come confronto. Le barre di errore denotano s.e. (n>180). (c-e) tracce in tempo reale di interazione HRas-cRafRBD. Si noti che la fluorescenza di fondo aumenta con la densità HRas superficie. Abbiamo usato la stessa concentrazione di preda di =10 nM. (f) Aumento della fluorescenza di fondo in funzione della densità superficiale di HRas. Tre set di dati, ottenuti con 10 nM (cerchi rossi), 20 nM (triangoli verdi) eGFP-cRafRBD e 20 nM eGFP ricombinante (diamanti blu), sono normalizzati dal corrispondente livello di fluorescenza di fondo misurato ad una bassa densità di superficie Ras di 0,38 HRas per μm2. Le barre di errore denotano s.d. (n>100). (G) Single-molecola frequenza spike in funzione della fluorescenza di fondo. Il set di dati ottenuti con 10 nM eGFP-cRafRBD viene utilizzato. Le barre di errore denotano s.e. (n>100).

Remarcabilmente, possiamo visualizzare i complessi di incontro variando la densità superficiale di HRas. Se la fluorescenza di fondo fosse un semplice prodotto del movimento browniano di eGFP-cRafRBD, dipenderebbe solo dalla concentrazione di cRafRBD. Tuttavia, la fluorescenza di fondo aumenta bruscamente con la densità di superficie di HRas anche se le concentrazioni di cRafRBD sono mantenute costanti (Fig. 2c-f). Ad un’alta densità di Ras di 6.4 HRas per μm2, la fluorescenza di fondo totale diventa tre volte superiore a quella osservata a 0.38 HRas per μm2 (Fig. 2c). La nostra simulazione numerica mostra che la presenza di processi di legame paralleli in un dato ROI può solo spiegare meno del 5% dell’aumento osservato (Fig. supplementare S9). Inoltre, quando le proteine preda sono stati cambiati per eGFP ricombinanti, che non interagiscono con le proteine HRas superficie-immobilizzato, la loro fluorescenza di fondo era essenzialmente invariante nella gamma di densità HRas abbiamo studiato (Fig. 2f, diamanti blu). Quindi, poiché abbiamo una densa popolazione di HRas attivi sulla superficie, sembra che ci siano effettivamente più molecole eGFP-cRafRBD che indugiano sopra la superficie di quanto ci si aspetterebbe dalla pura diffusione browniana. Questi complessi d’incontro nascono da veloci interazioni pre-equilibranti tra le proteine HRas e cRafRBD24, la cui dinamica è al di là della nostra risoluzione temporale.

Allora ci siamo chiesti se i complessi d’incontro servano effettivamente come substrati per il complesso finale HRas-cRafRBD. A questo scopo, abbiamo valutato la frequenza dei picchi di fluorescenza generati da una singola proteina HRas immobilizzata in superficie. Abbiamo ragionato sul fatto che se i complessi di incontro sono veri su intermedi del percorso per il complesso finale Ras-Raf, la frequenza dei picchi a singola molecola dovrebbe crescere con l’aumento della fluorescenza di fondo nonostante la stessa concentrazione di cRafRBD alla rinfusa. Per ottenere la singola molecola frequenza spike in HRas ambienti densi, abbiamo misurato kbind utilizzando un più piccolo 3 per 3 ROI pixel (0,18 μm2) e diviso il valore misurato kbind per il numero medio di HRas in ogni 3 per 3 ROI pixel (Fig. supplementare S10). In linea di massima, questa frequenza di spike singola molecola è aumentato con la fluorescenza di fondo (Fig. 2g, 10 nM eGFP-cRafRBD utilizzato). La nostra osservazione suggerisce che le proteine a valle concentrati in forma di complessi incontro portare alla formazione del complesso Ras-Raf con una frequenza aumentata.

Singola-molecola co-IP analisi delle proteine di segnalazione nei tumori

Abbiamo finora dimostrato la misura in tempo reale della cinetica di interazione proteina-proteina durante singola molecola co-IP. In questi esperimenti, tuttavia, le proteine esca e preda sono fuse a tag di proteine fluorescenti, ponendo la questione se possiamo estendere questa tecnica alle proteine native. A tal fine, abbiamo espresso HRas mutato (G12V) in una linea di cellule epiteliali mammarie umane non tumorali (MCF10A) per trasformarle in cellule cancerose25 (Fig. 3a). Queste cellule trasformate, che hanno mostrato una crescita senza siero (Fig. supplementare S11), hanno formato tumori quando iniettato nel cuscinetto di grasso mammario di topi immunocompromessi (Fig. 3b). I tessuti tumorali sono stati ottenuti 17 giorni dopo lo xenotrapianto, e i tessuti di controllo sono stati preparati dalle stesse parti di topi nudi non trattati.

(a,b) Trasformazione di cellule MCF10A in cellule cancerose tramite trasduzione retrovirale HRas (G12V). Questa mutazione a punto singolo è nota per rendere HRas costitutivamente attivo. L’iniezione delle cellule cancerose nel cuscinetto mammario di topi nudi porta alla formazione del tumore. Barra della scala, 5 mm. (c) Schema di singola molecola analisi western blot. Concorrenza tra Ras cellulare e sonda per il legame con l’anticorpo primario riduce il numero di Ras sonda specificamente legato alla superficie, che di conseguenza riduce il numero di macchie fluorescenti. Si noti che, come ogni anticorpo primario si lega a due proteine Ras, un punto fluorescente scompare quando entrambi i due bracci della catena leggera sono occupati da Ras cellulare. (d) Prototipo di misura singola molecola western blot. 298 nM mCherry-HRas è stato usato come proteina bersaglio. Con 32,5 nM eGFP-HRas come sonda, la concentrazione della proteina bersaglio è stata misurata a 288 ± 1,4 nM. Barra di errore denota s.d. (n=20). (e) Livelli di espressione di Ras misurati attraverso il processo di tumorigenesi da a,b. Le barre di errore indicano s.d. (n=20). (f) Schema di imaging co-IP in tempo reale per HRas nativo. (g-j) tracce in tempo reale di co-IP imaging. Le concentrazioni HRas utilizzati per tirare giù sono 3.0 (g), 41.3 (h), 3.5 (i) e 49 nM (j). La frequenza di picchi di fluorescenza è stata significativamente aumentata per l’estratto di tessuto del cancro quando HRas pull-down è stato aumentato da 1,6 a 22 HRas per μm2 (g contro h). Questo non è stato osservato con l’estratto di tessuto di controllo (i contro j). (k) Schema di inflazione kbind. In condizioni sparse di esche attive sulla superficie, una costante, kbind monomolecola si ottiene anche quando la superficie pull-down di esche è aumentato (sinistra due pannelli). Tuttavia, oltre la soglia a 0,6 esche attive per μm2, più di una esca sono presenti per ROI in media. Queste esche multiple hanno l’effetto di aumentare kbind misurato da ogni ROI (pannello di destra). (L) kbind in funzione di HRas pull-down. Barre di errore denotano s.e. (n>180).

Nel tentativo di descrivere questa tumorigenesi quantitativamente, abbiamo usato strati tandem di anticorpi; un anticorpo secondario biotinilato superficie-immobilizzato e un Ras-specifico primario anticorpo1,2. Questo ha permesso la cattura di Ras nativo, non etichettato così come Ras etichettato (Fig. 3c). Abbiamo prima monitorato i livelli di espressione Ras quantitativamente attraverso il processo di tumorigenesi. Estratti di cellule o tessuti sono stati mescolati con un lisato di cellule HEK293 diluito, che conteneva Ras sonda (eGFP-HRas) di concentrazione nota. Nelle condizioni di reazione che saturano completamente i siti di legame dell’anticorpo primario, questa miscelazione porta ad una concorrenza per Ras-specifica legame anticorpo tra la sonda Ras e Ras cellulare bersaglio (Fig. 3c, a sinistra). Il numero di molecole Ras sonda legato agli anticorpi primari cade come la concentrazione di Ras cellulare bersaglio aumenta. Questo legame competitivo diminuisce il numero di macchie di fluorescenza sulla superficie (Fig. 3c, a destra), che segue l’equazione di quando normalizzato ad una condizione di legame solo Ras sonda (Fig. supplementare S12). Misurando il numero di molecole di sonda legati a diverse diluizioni diverse, siamo stati in grado di misurare in modo specifico e robusto la concentrazione molare di Ras bersaglio cellulare in estratti di cellule e tessuti (Fig. 3d e Fig. supplementare S12). Questa singola molecola analisi western blot indicato livelli di espressione Ras di 42 e 59 nM in 1 mg ml-1 estratti delle cellule cancerose MCF10A e tessuti tumorali xenotrapianto, rispettivamente, mentre un livello di base di 7 nM è stato misurato in 1 mg ml-1 estratti del tessuto di controllo (Fig. 3e).

Inoltre, siamo stati anche in grado di replicare il tempo reale singola molecola co-IP imaging da Figs. 1 e 2 su questo nativo Ras-cattura superficie. Dopo aver tirato giù HRas dal tumore o estratti di tessuto di controllo sulla superficie anticorpale tandem, abbiamo applicato un lisato cellulare sonda, un lisato diluito delle cellule HEK293 con 20 nM eGFP-cRafRBD proteine preda (Fig. 3f). Abbiamo analizzato le tracce di co-IP in tempo reale per determinare i tassi cinetici kbind e kdiss (Fig. 3g-j). E ‘importante notare che le informazioni di concentrazione dalla singola molecola analisi western blot (Fig. 3e) è stato fondamentale per garantire una concentrazione HRas specificato per ogni pull down quando il tumore e gli estratti di tessuto di controllo aveva livelli di espressione HRas disparati. Utilizzando i dati di calibrazione per superficie pull down (Fig. supplementare S13), le informazioni di concentrazione è stato infine convertito in una densità di superficie specifica di proteine HRas tirato giù (Fig. 3g-j).

Abbiamo studiato sistematicamente il cambiamento in kbind mentre precisamente aumentando la densità di superficie di proteine HRas pull-down (Fig. 3k). Presumiamo che, come risultato della regolazione cellulare, solo un sottoinsieme di proteine HRas sulla superficie dovrebbe essere nello stato caricato di GTP e mostrare eventi di legame attivo con le proteine preda. In una condizione sparsa in cui la distanza tra vicine molecole HRas attivo è molto più grande del diametro di ogni ROI, la cinetica osservata da ogni ROI dovrebbe essere indipendente dalla superficie totale HRas immobilizzazione e semplicemente segnalare l’attività di singole proteine HRas (Fig. 3k, due pannelli di sinistra e Supplementary Fig. S14). Come la superficie diventa più affollato con HRas attivo, ci dovrebbe essere una soglia in cui ci comincia ad essere più di una molecole HRas attivo per ROI. Una volta superata questa soglia, le molecole HRas attivo extra in ogni ROI produrrebbe ulteriori picchi di fluorescenza che di conseguenza gonfiare kbind (Fig. 3k, pannello destro e Fig. supplementare S14). Infatti, abbiamo osservato tale tendenza bifasica di kbind per il tessuto tumorale, con una soglia a ~ 3 HRas tirato giù per μm2 (Fig. 3l).

Quindi, al di sotto della soglia per l’inflazione kbind, la cinetica osservato spike sarebbe in gran parte riflettono l’attività di singole molecole HRas. In particolare, a 1,6-1,9 HRas tirato giù per μm2, simili valori kbind di 0,28 s-1 e 0,22 s-1 sono stati osservati per il tumore e controllo tessuto derivato proteine HRas, rispettivamente (Fig. 3l). Le misure kdiss erano anche molto simili a 2,5 s-1 (Fig. supplementare S15). Il singolo HRas oncogeno derivato dal tumore aveva di conseguenza una costante di dissociazione apparente di 180 nM, e questo era molto simile alla costante di dissociazione di 230 nM per l’HRas attivo dall’estratto di tessuto di controllo. Le nostre osservazioni indicano un fatto cruciale: l’attività su singola molecola dell’HRas oncogeno non è drammaticamente diversa da quella di un HRas wild-type attivato.

Allora, cosa distingue questo stato canceroso dallo stato normale? La soglia di inflazione di kbind ci permette di quantificare un’altra importante statistica delle proteine di segnalazione cellulare, la proporzione di proteine HRas che si legano attivamente con cRafRBD. Intuitivamente, la soglia per l’inflazione kbind dovrebbe corrispondere a una specifica densità di superficie di proteine esca ‘attive’. Nel nostro schema di imaging, questa soglia è stato trovato per essere a 0,6 esche attive per μm2, che non dipende dai tipi dettagliati di esche e proteine preda (Fig. supplementare S13). Come la soglia per l’inflazione kbind è stato osservato a totale 3 HRas tirato giù per μm2, la frazione di HRas attivo è stato direttamente stimato essere circa il 20% per il tessuto tumorale. Al contrario, non siamo stati in grado di osservare l’inflazione kbind quando anche 25 proteine HRas sono stati tirati giù per μm2 dal tessuto di controllo (Fig. 3l). Queste osservazioni indicano che l’HRas oncogeno derivato dal tessuto tumorale ha una frazione attiva più alta dell’HRas derivato dal tessuto di controllo di un ordine di grandezza.

Infine ci siamo chiesti se questa proporzione più alta di Ras attivo potrebbe essere una semplice conseguenza della sovraespressione HRas nel tumore xenotrapiantato. Le proteine HRas sovraespresse potrebbero superare i partner di legame putativi, lasciati disponibili per il legame con Raf marcato con eGFP. Per affrontare direttamente questa domanda, abbiamo testato due linee cellulari di cancro al seno umano, MCF-7 che ha KRas wild-type e MDA-MB-231 che ha una forma mutante di KRas (G13D; Fig. 4). In particolare, le cellule MDA-MB-231 sono note per mostrare la dipendenza dell’oncogene dal gene KRas mutato e dipendono criticamente dalla segnalazione aberrante di KRas per la loro sopravvivenza26,27. Utilizzando queste due linee cellulari, siamo anche in grado di determinare se i nostri metodi si applicano alla segnalazione KRas, che ha importanza fondamentale nella diagnostica molecolare e trattamento di molti tumori umani28.

(a,b) Analisi western blot monomolecolare dei livelli di espressione di KRas. Il livello di espressione del KRas wild-type nella linea MCF-7 è stato misurato a 17,3±1,3 nM, mentre quello del KRas mutante G13D nella linea MDA-MB-231 è stato misurato a 5,5±0,3 nM per 1 mg ml-1 di estratto. Le barre di errore indicano s.d (n=200). (c) kbind come funzione di KRas pull down. Si noti lo stesso valore di kbind condiviso dal KRas wild-type e mutante nella regione della cinetica della singola molecola (la linea piatta comune). La soglia per kbind è stata misurata a 1,2 KRas tirato giù per μm2 per il KRas mutante da MDA-MB-231, che ha dato una frazione attiva stimata del 50%. Questo valore era di un ordine di grandezza superiore al 6% del KRas wild-type della MCF-7, che aveva la soglia a 10 KRas abbattute per μm2. Le barre di errore indicano la s.e. (n>150).

Abbiamo tirato giù direttamente KRas da questi estratti cellulari usando un anticorpo primario specifico per KRas. La nostra analisi western blot a singola molecola ha mostrato che il KRas wild-type nelle cellule MCF-7 ha una concentrazione maggiore (17 nM) rispetto al KRas mutante nelle cellule MDA-MB-231 (5,5 nM in 1 mg ml-1 estratti; Fig. 4a e Fig. supplementare S16). Considerando la dipendenza dall’oncogene KRas delle cellule MDA-MB-231, il loro minore livello di espressione KRas era un’osservazione piuttosto inaspettata. Inoltre, la cinetica di segnalazione a singola molecola per il KRas wild-type e mutante è essenzialmente la stessa (Fig. 4c, la linea piatta comune; vedi Fig. supplementare S15 per kdiss). D’altra parte, la nostra co-IP in tempo reale a singola molecola risolve che la soglia per l’inflazione di kbind per il KRas mutante da MDA-MB-231 è identificata a 1,2 KRas tirato giù per μm2, mentre la soglia è osservata a ~ 10 KRas tirato giù per μm2 per il KRas wild-type da MCF-7 (Fig. 4c). Poiché l’inflazione kbind avviene sempre a 0,6 esche attive per μm2, queste soglie disparate indicano direttamente che la frazione attiva del KRas mutante che si lega fortemente al suo bersaglio a valle (15 nM cRafRBD) è del 50%, quasi un ordine di grandezza superiore al 6% mostrato dal KRas wild-type. Quindi, la frazione attiva più alta esibita dal mutante Ras oncogeno non è chiaramente un artefatto di sovraespressione, perché il KRas mutante è stato espresso a livelli più bassi, ma ha mostrato una frazione attiva più alta rispetto al tipo selvaggio.