Einzelmolekül-Co-Immunpräzipitationsanalysen enthüllen krebsspezifische Ras-Signaldynamik

Echtzeit-Bildgebung von Einzelmolekül-Co-IP

Wir zeigen zunächst, dass die Kinetik einer Protein-Protein-Interaktion in Zellextrakten auf Einzelmolekülebene gemessen werden kann (Abb. 1). Als Modellinteraktion in einem Zellsignalweg wählten wir die Interaktion zwischen Ras und Raf, die den ersten Schritt des konservierten MAPK-Weges darstellt, der bei vielen menschlichen Krebsarten überaktiviert ist5,6,7. Wir verwendeten die Ras-Bindungsdomäne von cRaf (cRafRBD) und eine Version von HRas mit einer Ein-Punkt-Mutation, Q61L, die es konstitutiv aktiv macht6,8,9,10,11,12. Die Bildgebung in lebenden Zellen von HeLa-Zellen, die diese beiden Proteine gemeinsam exprimieren, zeigte ein hohes Maß an Ko-Lokalisierung (Abb. 1a und ergänzende Abb. S2). Wir konnten diese Ko-Lokalisierung mit der durch Rapamycin ausgelösten Translokation von HRas zur Plasmamembran13 in Verbindung bringen, was zu einer gleichzeitigen Lokalisierung von cRafRBD an denselben Stellen führte. Die konventionelle Co-IP ergab ebenfalls eine deutliche Westernbande, die auf eine selektive Protein-Protein-Interaktion zwischen konstitutiv aktivem HRas und cRafRBD hinweist (Abb. 1b, links). Wir fanden jedoch heraus, dass diese scheinbar klare Proteinbande nur weniger als 5 % der gesamten Beuteproteine enthielt, was darauf hindeutet, dass die Beuteproteine möglicherweise nicht stabil an die Köder gebunden sind, sondern durch Waschvorgänge in den Durchflussbereich entfernt wurden (Abb. 1b, rechts und ergänzende Abb. S3). Wir weisen außerdem darauf hin, dass sowohl die Lebendzell-Bildgebung als auch die Co-IP-Ansätze die tatsächliche Kinetik dieser möglicherweise schwachen, vorübergehenden Protein-Protein-Interaktion nicht aufschlüsseln können.

(a) Lebendzell-Ko-Lokalisierungsstudie für die HRas-cRafRBD-Interaktion. Protein-Protein-Interaktionen zwischen HRas und cRafRBD wurden durch Beobachtung der Translokation von cRafRBD zur Plasmamembran zusammen mit HRas untersucht. CA und DN bezeichnen die konstitutiv aktive bzw. dominant negative Form von HRas. Maßstabsbalken, 10 μm. (b) Konventionelle Co-IP-Daten für die HRas-cRafRBD-Interaktion. Für die Co-IP-Analysen wurden GST-cRafRBD (links) bzw. mCherry-HRas-Proteine (rechts) als auf Beads immobilisierte Köder verwendet. (c) Schematische Darstellung der Einzelmolekül-Co-IP in Echtzeit. (d) TIRF-Bild von immobilisiertem mCherry-HRas auf der Oberfläche. Maßstabsleiste, 10 μm. (e) Aufeinanderfolgende Bilder aus der Echtzeit-Bildgebung von Einzelmolekül-Co-IP. Die Echtzeitspur dieser Bindungsereignisse ist in f dargestellt und mit einem roten Quadrat markiert. Maßstabsleiste, 1 μm. (f,g) Beispielhafte Echtzeitspuren der Einzelmolekül-Co-IP-Bildgebung in Echtzeit. Das Signal besteht hauptsächlich aus einer diffusen Hintergrundfluoreszenz, die von einer Reihe von Fluoreszenzspitzen überlagert wird. (h) Ein Negativkontrollexperiment mit oberflächenimmobilisiertem DN HRas (S17N). (i) Verteilung kbind für das Experiment in f. Die relevanten kinetischen Raten wurden mit Hilfe einer einfach-exponentiellen Kurvenanpassung (durchgezogene Linien) bestimmt. (j) Ein zweites Experiment als Negativkontrolle mit oberflächenimmobilisiertem FLAG-eGFP. (k) Verteilung von kdiss für das Experiment in f. und kblinking für das Experiment in j. Die relevanten kinetischen Raten wurden mit Hilfe einer einfach-exponentiellen Kurvenanpassung (durchgezogene Linien) bestimmt. Fehlerbalken bezeichnen den Standardfehler (s.e.; n>200).

Um die HRas-cRafRBD-Interaktion in Echtzeit auf Einzelmolekülebene zu visualisieren, fusionierten wir das HRas-Gen mit dem rot fluoreszierenden Protein mCherry und cRafRBD mit dem grün fluoreszierenden Protein (eGFP; Abb. 1c). Wir exprimierten jedes Protein in einer separaten Gruppe von HEK293-Zellen. Wir verwendeten die Strategie des Einzelmolekül-Pulldowns, um mCherry-HRas auf der Oberfläche zu immobilisieren2,3 (Abb. 1c). Anschließend injizierten wir das zweite Ganzzell-Lysat, das eGFP-cRafRBD enthielt, auf die mCherry-HRas-immobilisierte Oberfläche, wie bei einem herkömmlichen Co-IP (Abb. 1c). Wir verwendeten ein TIR-Mikroskop (Total Internal Reflection), um ein evaneszentes elektrisches Feld zu erzeugen, das selektiv eGFP-cRafRBDs anregte, die sich innerhalb von 100 nm der Oberfläche befanden. Um schwache Protein-Protein-Wechselwirkungen zu beobachten, wurden einzelne eGFP-cRafRBDs, die an der Oberfläche ankamen, in Echtzeit überwacht, während das zweite Ganzzell-Lysat in der Kammer aufbewahrt wurde (Abb. 1c).

Abbildung 1f zeigt eine typische Echtzeitspur dieser Einzelmolekül-Co-IP-Präparation. Jede Spur wurde durch Integration des Fluoreszenzsignals über eine kreisförmige Region of Interest (ROI) mit einer Fläche von 1,1 μm2 erzeugt (Abb. 1e). Wir kontrollierten die Oberflächendichte von mCherry-HRas, um einen Durchschnitt von 0,5 HRas-Molekülen pro ROI beizubehalten (ergänzende Abb. S4). Außerdem verwendeten wir während der Signalintegration eine Gauß-Filterung und einen strengen Schwellenwert für die Signalerkennung, um sicherzustellen, dass die Echtzeitspuren die Bindungsereignisse einzelner HRas-Proteine wiedergeben (Abb. 1g und ergänzende Abb. S5). Jede Echtzeitspur besteht eindeutig aus zwei Teilen: einer Hintergrundfluoreszenz und einzelnen Fluoreszenzspitzen. Jedes eGFP-cRafRBD-Molekül, das sich gemäß der Brownschen Bewegung bewegt, sollte weniger als 50 μs pro Besuch der TIR-Anregungsschicht benötigen. Da 50 μs um drei Größenordnungen kürzer sind als die Zeitauflösung unseres Bildgebungsgeräts (50 ms), erzeugt die Brownsche Bewegung vieler eGFP-cRafRBD-Moleküle ein konstantes Niveau der Hintergrundfluoreszenz. Die einzelnen Fluoreszenzspitzen zeigen dagegen an, dass ein einzelnes eGFP-cRafRBD mit einem Molekül auf der Oberfläche lange genug interagiert hat, um die 50 ms Signalintegration zu überleben.

Als nächstes analysierten wir die wesentliche Kinetik dieser Protein-Protein-Interaktion, indem wir τoff, die Zeit zwischen den Bindungsereignissen, und τon, die Dauer eines einzelnen Bindungsereignisses, analysierten (Abb. 1g). Die Anpassung einfacher Exponentialgleichungen an die Verteilungen von τoff und τon ergibt die kinetischen Raten von kbind bzw. kdiss. Um sicherzustellen, dass die Fluoreszenzspitzen tatsächlich das Ergebnis einer spezifischen HRas-cRafRBD-Interaktion sind, führten wir dasselbe eGFP-cRafRBD-Bindungsexperiment mit oberflächenimmobilisiertem dominant negativem HRas (S17N) durch, das eine geringere Affinität zu GTP aufweist14,15. Mit der dominant negativen Form war die Fluoreszenzspitzenfrequenz (kbind) stark vermindert (Abb. 1h). Diese Negativkontrolle beweist, dass die Fluoreszenzspitzen weder Artefakte einer einfachen eGFP-cRafRBD-Oberflächenadsorption sind noch auf die Oberflächenimmobilisierung anderer Proteine mit unerwünschten eGFP-cRafRBD-Interaktionen zurückzuführen sind. Stattdessen geben diese Fluoreszenzspitzen die HRas-cRafRBD-Bindungsereignisse getreu wieder.

Bemerkenswert ist auch, dass die Dauer eines einzelnen Bindungsereignisses typischerweise nur einige hundert ms beträgt (Abb. 1f). Wir untersuchten die Blinzeldynamik von FLAG-eGFP16, das mit einem Anti-FLAG-Antikörper auf einer Oberfläche immobilisiert wurde (Abb. 1j). Das Photoblinken von FLAG-eGFP findet im Durchschnitt alle paar Sekunden statt, was eine kinetische Rate von weniger als 0,3 s-1 ergibt, und diese eGFP-Photoblinkrate ist um eine Größenordnung langsamer als die von uns gemessene kdiss (Abb. 1k). Darüber hinaus haben wir alle kinetischen Einzelmolekülraten von kbind und kdiss unter Verwendung eines Kriteriums für die Ko-Lokalisierung, das die Ko-Lokation der Fluoreszenzsignale der mCherry-HRas- und eGFP-cRafRBD-Proteine voraussetzt, neu validiert (ergänzende Abb. S6). Somit muss die HRas-cRafRBD-Interaktion tatsächlich einen schnellen Umsatz haben, einige Male pro Sekunde11,12.

Visualisierung von Begegnungskomplexen bei der Ras-Raf-Interaktion

Die detaillierte Analyse der HRas-cRafRBD-Bindungshäufigkeit (kbind) deutet auf die Existenz von schnell ausgleichenden Begegnungskomplexen17,18,19,20,21 hin, bei denen es sich um lose Protein-Protein-Interaktionsintermediate handelt, die vor der Bildung des endgültigen HRas-cRafRBD-Komplexes besiedelt werden sollten (Abb. 2). Als wir die Konzentration von eGFP-cRafRBD von 5 auf 50 nM erhöhten, zeigte die kbind einen parabolischen Anstieg (Abb. 2a), der sich am besten an die Gleichung mit einem Hill-Koeffizienten (n) von 1,1 (22,23), einer Dissoziationskonstante (K1) von 43 nM für die Bildung des Begegnungskomplexes und einem κon von 2 anpassen lässt.16 s-1 nM-1, d. h. die kinetische Rate der Bildung des endgültigen Bindungszustands aus einem Begegnungskomplex (ergänzende Methoden und ergänzende Abb. S7). kdiss hingegen ist für die von uns untersuchten eGFP-cRafRBD-Konzentrationen weitgehend konstant (Abb. 2b). Diese mit unserer Echtzeit-Einzelmolekül-Co-IP gemessenen kinetischen Raten stimmen gut mit früheren Berichten über biochemische Massenassays überein (ergänzende Tabelle S1). Eine Anmerkung ist, dass wir eine vorherrschende Konformation für den endgültigen HRas-cRafRBD-Komplex angenommen haben. Obwohl unsere Annahme durch die unimodalen Verteilungen der Fluoreszenzspitzenintensität bestätigt wird (ergänzende Abb. S8), können wir die Möglichkeit nicht völlig ausschließen, dass es mehrere Konformationen für den HRas-cRafRBD-Komplex gibt, zu denen mehrere Wege führen.

(a) kbind als Funktion der cRafRBD-Konzentration. Zum Vergleich ist ein linearer Anstieg von kbind dargestellt. (b) kdiss in Abhängigkeit von der cRafRBD-Konzentration. Zum Vergleich ist kblinking aus dem Experiment in Abb. 1j dargestellt. Die Fehlerbalken bezeichnen s.e. (n>180). (c-e) Echtzeit-Aufnahmen der HRas-cRafRBD-Interaktion. Man beachte, dass die Hintergrundfluoreszenz mit der HRas-Dichte an der Oberfläche zunimmt. Wir haben die gleiche Beutekonzentration von =10 nM verwendet. (f) Anstieg der Hintergrundfluoreszenz in Abhängigkeit von der HRas-Dichte an der Oberfläche. Drei Datensätze, die mit 10 nM (rote Kreise), 20 nM (grüne Dreiecke) eGFP-cRafRBD und 20 nM rekombinantem eGFP (blaue Rauten) erhalten wurden, sind durch den entsprechenden Hintergrundfluoreszenzwert normalisiert, der bei einer niedrigen Oberflächen-Ras-Dichte von 0,38 HRas pro μm2 gemessen wurde. Die Fehlerbalken geben den s.d. an (n>100). (g) Einzelmolekül-Spike-Häufigkeit als Funktion der Hintergrundfluoreszenz. Es wird der mit 10 nM eGFP-cRafRBD erhaltene Datensatz verwendet. Die Fehlerbalken bezeichnen s.e. (n>100).

Besonders bemerkenswert ist, dass wir die Begegnungskomplexe durch Variation der Oberflächendichte von HRas sichtbar machen können. Wenn die Hintergrundfluoreszenz ein einfaches Produkt der Brownschen Bewegung von eGFP-cRafRBD wäre, würde sie nur von der cRafRBD-Konzentration abhängen. Die Hintergrundfluoreszenz steigt jedoch steil mit der Oberflächendichte von HRas an, auch wenn die cRafRBD-Konzentrationen konstant gehalten werden (Abb. 2c-f). Bei einer hohen Ras-Dichte von 6,4 HRas pro μm2 ist die gesamte Hintergrundfluoreszenz dreimal so hoch wie die bei 0,38 HRas pro μm2 beobachtete (Abb. 2c). Unsere numerische Simulation zeigt, dass das Vorhandensein paralleler Bindungsprozesse in einer bestimmten ROI nur für weniger als 5 % des beobachteten Anstiegs verantwortlich sein kann (ergänzende Abb. S9). Wenn die Beuteproteine in rekombinante eGFPs umgewandelt wurden, die nicht mit den an der Oberfläche immobilisierten HRas-Proteinen interagieren, blieb ihre Hintergrundfluoreszenz in dem von uns untersuchten HRas-Dichtebereich im Wesentlichen unverändert (Abb. 2f, blaue Rauten). Da wir also eine dichte Population aktiver HRas auf der Oberfläche haben, scheint es tatsächlich mehr eGFP-cRafRBD-Moleküle zu geben, die über der Oberfläche verweilen, als durch reine Brownsche Diffusion zu erwarten wäre. Diese Begegnungskomplexe entstehen durch schnelle, vor dem Gleichgewicht stattfindende Wechselwirkungen zwischen HRas- und cRafRBD-Proteinen24, deren Dynamik jenseits unserer zeitlichen Auflösung liegt.

Als nächstes fragten wir uns, ob die Begegnungskomplexe tatsächlich als Substrate für den endgültigen HRas-cRafRBD-Komplex dienen. Zu diesem Zweck untersuchten wir die Häufigkeit der Fluoreszenzspitzen, die von einem einzelnen oberflächenimmobilisierten HRas-Protein erzeugt werden. Wir gingen davon aus, dass die Häufigkeit der Einzelmolekülspikes trotz gleicher cRafRBD-Konzentration mit zunehmender Hintergrundfluoreszenz ansteigen sollte, wenn die Begegnungskomplexe tatsächlich Zwischenstufen für den endgültigen Ras-Raf-Komplex sind. Um die Einzelmolekül-Spike-Häufigkeit in HRas-dichten Umgebungen zu erhalten, haben wir kbind unter Verwendung einer kleineren 3 x 3-Pixel-ROI (0,18 μm2) gemessen und den gemessenen kbind-Wert durch die durchschnittliche Anzahl von HRas in jeder 3 x 3-Pixel-ROI geteilt (ergänzende Abb. S10). Im Großen und Ganzen nahm diese Einzelmolekül-Spike-Häufigkeit mit der Hintergrundfluoreszenz zu (Abb. 2g, Verwendung von 10 nM eGFP-cRafRBD). Unsere Beobachtung deutet darauf hin, dass die konzentrierten Downstream-Proteine in Form von Begegnungskomplexen zur Bildung des Ras-Raf-Komplexes mit erhöhter Frequenz führen.

Einzelmolekül-Co-IP-Analyse von Signalproteinen in Krebserkrankungen

Wir haben bisher die Echtzeit-Messung der Protein-Protein-Interaktionskinetik bei Einzelmolekül-Co-IP demonstriert. Bei diesen Experimenten sind die Köder- und Beuteproteine jedoch mit fluoreszierenden Protein-Tags fusioniert, was die Frage aufwirft, ob wir diese Technik auf native Proteine ausweiten können. Zu diesem Zweck exprimierten wir mutiertes HRas (G12V) in einer nicht-tumorigenen menschlichen Brustepithelzelllinie (MCF10A), um sie in Krebszellen zu verwandeln25 (Abb. 3a). Diese transformierten Zellen, die ein serumfreies Wachstum zeigten (ergänzende Abb. S11), bildeten Tumore, wenn sie in das Brustfettpolster von immungeschwächten Mäusen injiziert wurden (Abb. 3b). Tumorgewebe wurde 17 Tage nach der Xenotransplantation gewonnen, und Kontrollgewebe wurde aus denselben Teilen unbehandelter Nacktmäuse gewonnen.

(a,b) Transformation von MCF10A-Zellen in Krebszellen durch retrovirale HRas (G12V) Transduktion. Diese Ein-Punkt-Mutation ist dafür bekannt, dass HRas konstitutiv aktiv wird. Die Injektion der Krebszellen in die Brustdrüse von Nacktmäusen führt zur Tumorbildung. Maßstabsbalken, 5 mm. (c) Schematische Darstellung der Einzelmolekül-Westernblot-Analyse. Die Konkurrenz zwischen zellulärem und Sonden-Ras um die Bindung an den primären Antikörper reduziert die Anzahl der spezifisch an die Oberfläche gebundenen Sonden-Ras, was wiederum die Anzahl der fluoreszierenden Flecken reduziert. Da jeder primäre Antikörper an zwei Ras-Proteine bindet, verschwindet ein Fluoreszenzpunkt, wenn beide Arme der leichten Kette von zellulärem Ras besetzt sind. (d) Prototypische Einzelmolekül-Westernblot-Messung. 298 nM mCherry-HRas wurde als Zielprotein verwendet. Mit 32,5 nM eGFP-HRas als Sonde wurde eine Zielproteinkonzentration von 288±1,4 nM gemessen. Fehlerbalken: s.d. (n=20). (e) Gemessene Ras-Expressionswerte im Verlauf der Tumorentstehung aus a,b. Fehlerbalken bezeichnen die s.d. (n=20). (f) Schematische Darstellung der Echtzeit-Co-IP-Bildgebung für natives HRas. (g-j) Echtzeit-Spuren der Co-IP-Bildgebung. Die für den Pull-down verwendeten HRas-Konzentrationen sind 3,0 (g), 41,3 (h), 3,5 (i) und 49 nM (j). Die Häufigkeit der Fluoreszenzspitzen war bei dem Krebsextrakt deutlich erhöht, als der HRas-Pull-down von 1,6 auf 22 HRas pro μm2 erhöht wurde (g gegen h). Dies wurde bei dem Kontrollgewebeextrakt nicht beobachtet (i versus j). (k) Schematische Darstellung der kbind-Inflation. Unter spärlichen Bedingungen aktiver Köder auf der Oberfläche wird eine konstante Einzelmolekül-Kbindungsrate erzielt, selbst wenn der Oberflächen-Pull-down der Köder erhöht wird (linke zwei Felder). Hinter dem Schwellenwert von 0,6 aktiven Ködern pro μm2 sind jedoch im Durchschnitt mehr als ein Köder pro ROI vorhanden. Diese mehrfachen Köder haben den Effekt, dass sie die von jeder ROI gemessene kbind erhöhen (rechte Tafel). (l) kbind als Funktion des HRas-Pulldowns. Fehlerbalken bezeichnen s.e. (n>180).

In dem Bemühen, diese Tumorgenese quantitativ zu beschreiben, haben wir Tandemschichten von Antikörpern verwendet: einen oberflächenimmobilisierten biotinylierten Sekundärantikörper und einen Ras-spezifischen Primärantikörper1,2. Dies ermöglichte die Erfassung von nativem, nicht markiertem Ras sowie von markiertem Ras (Abb. 3c). Zunächst verfolgten wir das Niveau der Ras-Expression quantitativ im Verlauf der Tumorentstehung. Zell- oder Gewebeextrakte wurden mit einem verdünnten HEK293-Zelllysat gemischt, das Sonden-Ras (eGFP-HRas) in bekannter Konzentration enthielt. Unter Reaktionsbedingungen, die die Bindungsstellen des primären Antikörpers vollständig sättigen, führt diese Vermischung zu einem Wettbewerb um die Ras-spezifische Antikörperbindung zwischen der Ras-Sonde und dem zellulären Ras (Abb. 3c, links). Die Anzahl der an die primären Antikörper gebundenen Sonden-Ras-Moleküle sinkt, wenn die Konzentration des zellulären Ziel-Ras steigt. Diese kompetitive Bindung verringert die Anzahl der Fluoreszenzflecken auf der Oberfläche (Abb. 3c, rechts), die der Gleichung folgt, wenn sie auf die Bedingung einer reinen Sonden-Ras-Bindung normiert wird (ergänzende Abb. S12). Durch die Messung der Anzahl der gebundenen Sondenmoleküle in verschiedenen Verdünnungen konnten wir die molare Konzentration des zellulären Ziel-Ras in Zell- und Gewebeextrakten spezifisch und zuverlässig messen (Abb. 3d und ergänzende Abb. S12). Diese Einzelmolekül-Westernblot-Analyse zeigte Ras-Expressionswerte von 42 und 59 nM in 1 mg ml-1-Extrakten der krebsartigen MCF10A-Zellen bzw. des Xenotransplantat-Tumorgewebes an, während in 1 mg ml-1-Extrakten des Kontrollgewebes ein Ausgangswert von 7 nM gemessen wurde (Abb. 3e).

Darüber hinaus konnten wir auch die Einzelmolekül-Co-IP-Bildgebung in Echtzeit aus Abb. 1 und 2 auf dieser nativen Ras-Capturing-Oberfläche wiederholen. Nachdem wir HRas aus Tumor- oder Kontrollgewebeextrakten auf die Tandem-Antikörperoberfläche gezogen hatten, applizierten wir ein Sonden-Zelllysat, ein verdünntes HEK293-Zelllysat mit 20 nM eGFP-cRafRBD-Präy-Proteinen (Abb. 3f). Wir analysierten Echtzeit-Co-IP-Spuren, um die kinetischen Raten kbind und kdiss zu bestimmen (Abb. 3g-j). Es ist wichtig zu beachten, dass die Konzentrationsinformationen aus der Einzelmolekül-Westernblot-Analyse (Abb. 3e) von entscheidender Bedeutung waren, um eine bestimmte HRas-Konzentration für jeden Pull-Down zu gewährleisten, wenn die Tumor- und Kontrollgewebeextrakte unterschiedliche HRas-Expressionsniveaus aufwiesen. Unter Verwendung der Kalibrierungsdaten für den Oberflächen-Pull-Down (ergänzende Abb. S13) wurde die Konzentrationsinformation schließlich in eine spezifische Oberflächendichte der Pull-Down-HRas-Proteine umgewandelt (Abb. 3g-j).

Wir untersuchten systematisch die Veränderung von kbind bei präziser Erhöhung der Oberflächendichte der Pull-Down-HRas-Proteine (Abb. 3k). Wir vermuten, dass aufgrund der zellulären Regulation nur eine Teilmenge der HRas-Proteine auf der Oberfläche im GTP-geladenen Zustand sein und aktive Bindungsereignisse mit den Beuteproteinen zeigen sollte. Unter einer spärlichen Bedingung, in der der Abstand zwischen benachbarten aktiven HRas-Molekülen viel größer ist als der Durchmesser jedes ROI, sollte die beobachtete Kinetik von jedem ROI unabhängig von der gesamten HRas-Oberflächenimmobilisierung sein und einfach die Aktivität einzelner HRas-Proteine wiedergeben (Abb. 3k, linke zwei Felder und ergänzende Abb. S14). Da die Oberfläche immer mehr mit aktiven HRas bevölkert wird, sollte es einen Schwellenwert geben, ab dem mehr als ein aktives HRas-Molekül pro ROI vorhanden ist. Sobald dieser Schwellenwert überschritten ist, würden die zusätzlichen aktiven HRas-Moleküle in jedem ROI zusätzliche Fluoreszenzspitzen erzeugen, die folglich kbind aufblähen würden (Abb. 3k, rechte Tafel und ergänzende Abb. S14). Tatsächlich beobachteten wir einen solchen biphasischen Trend von kbind für das Tumorgewebe, mit einem Schwellenwert bei ~3 HRas pro μm2 (Abb. 3l).

Unterhalb des Schwellenwerts für die kbind-Inflation würde die beobachtete Spike-Kinetik also weitgehend die Aktivität einzelner HRas-Moleküle widerspiegeln. Bemerkenswerterweise wurden bei 1,6-1,9 HRas, die pro μm2 heruntergezogen wurden, ähnliche kbind-Werte von 0,28 s-1 bzw. 0,22 s-1 für die aus dem Tumor- und Kontrollgewebe stammenden HRas-Proteine beobachtet (Abb. 3l). Die kdiss-Messungen waren bei 2,5 s-1 ebenfalls sehr ähnlich (ergänzende Abb. S15). Das aus dem Tumor stammende einzelne onkogene HRas hatte demnach eine scheinbare Dissoziationskonstante von 180 nM, was der Dissoziationskonstante von 230 nM für das aktive HRas aus dem Extrakt des Kontrollgewebes sehr ähnlich war. Unsere Beobachtungen weisen auf die entscheidende Tatsache hin, dass sich die Einzelmolekülaktivität der onkogenen HRas nicht dramatisch von der einer aktivierten Wildtyp-HRas unterscheidet.

Was unterscheidet dann diesen Krebszustand vom normalen Zustand? Der Schwellenwert für die kbind-Inflation ermöglicht es uns, eine andere wichtige Statistik der Zellsignalproteine zu quantifizieren, nämlich den Anteil der HRas-Proteine, die aktiv an cRafRBD binden. Intuitiv sollte der Schwellenwert für die kbind-Inflation einer bestimmten Oberflächendichte von „aktiven“ Köderproteinen entsprechen. In unserem Bildgebungsschema lag dieser Schwellenwert bei 0,6 aktiven Köderproteinen pro μm2, was nicht von den einzelnen Arten von Köder- und Beuteproteinen abhängt (ergänzende Abb. S13). Da der Schwellenwert für die kbind-Inflation bei insgesamt 3 HRas, die pro μm2 heruntergezogen wurden, beobachtet wurde, wurde der Anteil der aktiven HRas für das Tumorgewebe direkt auf etwa 20 % geschätzt. Im Gegensatz dazu konnten wir keine kbind-Inflation beobachten, wenn sogar 25 HRas-Proteine pro μm2 aus dem Kontrollgewebe heruntergezogen wurden (Abb. 3l). Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass das aus dem Tumorgewebe stammende onkogene HRas einen um eine Größenordnung höheren aktiven Anteil hat als das aus dem Kontrollgewebe stammende HRas.

Wir fragten uns schließlich, ob dieser höhere Anteil an aktivem Ras eine einfache Folge der HRas-Überexpression im xenotransplantierten Tumor sein könnte. Die überexprimierten HRas-Proteine könnten die Zahl der mutmaßlichen Bindungspartner übersteigen, die für die Bindung an eGFP-markierten Raf zur Verfügung stehen. Um diese Frage direkt zu klären, testeten wir zwei humane Brustkrebszelllinien, MCF-7 mit Wildtyp-KRas und MDA-MB-231 mit einer mutierten Form von KRas (G13D; Abb. 4). Insbesondere von den MDA-MB-231-Zellen ist bekannt, dass sie eine Onkogen-Sucht nach dem mutierten KRas-Gen aufweisen und für ihr Überleben entscheidend von der aberranten KRas-Signalübertragung abhängen26,27. Anhand dieser beiden Zelllinien können wir auch feststellen, ob unsere Methoden auf den KRas-Signalweg anwendbar sind, der für die molekulare Diagnostik und Behandlung vieler menschlicher Krebsarten von zentraler Bedeutung ist28.

(a,b) Einzelmolekül-Westernblot-Analysen der KRas-Expressionsniveaus. eGFP-markiertes KRas wurde als Sonde Ras verwendet. Das Expressionsniveau des Wildtyp-KRas in der MCF-7-Linie wurde mit 17,3±1,3 nM gemessen, während das der G13D-Mutante KRas in der MDA-MB-231-Linie mit 5,5±0,3 nM pro 1 mg ml-1 Extrakte gemessen wurde. Die Fehlerbalken bezeichnen s.d. (n=200). (c) kbind als Funktion des KRas-Pulldowns. Beachten Sie den gleichen kbind-Wert für Wildtyp und mutiertes KRas im Bereich der Einzelmolekülkinetik (die gemeinsame flache Linie). Der Schwellenwert für kbind wurde bei 1,2 heruntergezogenen KRas pro μm2 für die KRas-Mutante aus MDA-MB-231 gemessen, was eine geschätzte aktive Fraktion von 50 % ergab. Dieser Wert war um eine Größenordnung höher als 6 % des Wildtyp-KRas aus MCF-7, bei dem der Schwellenwert bei 10 KRas pro μm2 lag, die heruntergezogen wurden. Die Fehlerbalken bezeichnen s.e. (n>150).

Wir zogen KRas direkt aus diesen Zellextrakten unter Verwendung eines KRas-spezifischen primären Antikörpers herunter. Unsere Einzelmolekül-Westernblot-Analyse zeigte, dass das Wildtyp-KRas in MCF-7-Zellen eine höhere Konzentration (17 nM) aufweist als das mutierte KRas in MDA-MB-231-Zellen (5,5 nM in 1 mg ml-1-Extrakten; Abb. 4a und ergänzende Abb. S16). In Anbetracht der KRas-Onkogen-Sucht von MDA-MB-231-Zellen war ihre geringere KRas-Expressionsmenge eine eher unerwartete Beobachtung. Außerdem ist die Einzelmolekül-Signalkinetik für den Wildtyp und die KRas-Mutante im Wesentlichen gleich (Abb. 4c, die gemeinsame flache Linie; siehe ergänzende Abb. S15 für kdiss). Andererseits zeigt unsere Einzelmolekül-Co-IP in Echtzeit, dass der Schwellenwert für die kbind-Inflation für das mutierte KRas aus MDA-MB-231 bei 1,2 KRas pro μm2 liegt, während der Schwellenwert für das Wildtyp-KRas aus MCF-7 bei ~10 KRas pro μm2 liegt (Abb. 4c). Da die kbind-Inflation immer bei 0,6 aktiven Ködern pro μm2 auftritt, deuten diese unterschiedlichen Schwellenwerte direkt darauf hin, dass der aktive Anteil des mutierten KRas, der stark an sein nachgeschaltetes Ziel (15 nM cRafRBD) bindet, 50 % beträgt, was fast eine Größenordnung höher ist als die 6 %, die das Wildtyp-KRas aufweist. Die höhere aktive Fraktion der onkogenen Ras-Mutante ist also eindeutig kein Artefakt der Überexpression, denn die KRas-Mutante wurde zwar in geringerer Menge exprimiert, zeigte aber eine höhere aktive Fraktion als der Wildtyp.