Real-time single-molecule co-immunoprecipitation analyses reveal cancer-specific Ras signalling dynamics

Real-time imaging of single-molecule co-IP

Po raz pierwszy pokazujemy, że kinetyka interakcji białko-białko może być mierzona w ekstraktach komórkowych na poziomie pojedynczej cząsteczki (Rys. 1). Jako modelową interakcję w szlaku sygnalizacji komórkowej wybraliśmy interakcję pomiędzy Ras i Raf, która jest początkowym etapem konserwowanej ścieżki MAPK, która jest nadaktywna w wielu ludzkich nowotworach5,6,7. Użyliśmy domeny wiążącej Ras z cRaf (cRafRBD) i wersji HRas zawierającej jednopunktową mutację, Q61L, która czyni ją konstytutywnie aktywną6,8,9,10,11,12. Obrazowanie komórek HeLa w żywych komórkach z koekspresją tych dwóch białek wykazało wysoki poziom kolokalizacji (Fig. 1a i Supplementary Fig. S2). Byliśmy w stanie skierować tę kolokalizację z wywołaną rapamycyną translokacją HRas do błony plazmatycznej13, co spowodowało równoczesną lokalizację cRafRBD w tych samych miejscach. Konwencjonalny co-IP również wytworzył wyraźne pasmo zachodnie, wskazujące na selektywną interakcję białko-białko między konstytutywnie aktywnym HRas i cRafRBD (Fig. 1b, po lewej). Jednakże odkryliśmy, że to pozornie wyraźne pasmo białkowe zawierało tylko mniej niż 5% całego białka ofiary, co sugeruje, że białka ofiary mogą nie być trwale związane z przynętami, ale usunięte do części przepływowej w procesach przemywania (Fig. 1b, po prawej i Uzupełniające Fig. S3). Zauważamy ponadto, że oba podejścia do obrazowania żywych komórek i co-IP nie mogą wyodrębnić rzeczywistej kinetyki tej być może słabej, przejściowej interakcji białko-białko.

(a) Badanie kolokalizacji żywych komórek dla interakcji HRas-cRafRBD. Interakcje białko-białko pomiędzy HRas i cRafRBD oceniano obserwując translokację cRafRBD do błony plazmatycznej wraz z HRas. CA i DN oznaczają odpowiednio konstytutywnie aktywną i dominująco ujemną formę HRas. Pasek skali, 10 μm. (b) Konwencjonalne dane co-IP dla interakcji HRas-cRafRBD. Do analizy co-IP użyto, odpowiednio, białek GST-cRafRBD (po lewej) i mCherry-HRas (po prawej) jako przynęt unieruchomionych na kulkach. (c) Schemat jednomolekularnego co-IP w czasie rzeczywistym. (d) Obraz TIRF unieruchomionego mCherry-HRas na powierzchni. Pasek skali, 10 μm. (e) Kolejne klatki z obrazowania w czasie rzeczywistym jednocząsteczkowego co-IP. Ślad w czasie rzeczywistym tych zdarzeń wiążących pokazano w f i zaznaczono czerwonym kwadratem. Pasek skali, 1 μm. (f,g) Przykładowe ślady w czasie rzeczywistym z obrazowania w czasie rzeczywistym jednocząsteczkowego co-IP. Sygnał składa się głównie z rozproszonej fluorescencji tła nałożonej na sekwencję skoków fluorescencji. (h) Negatywny eksperyment kontrolny z powierzchniowo immobilizowanym DN HRas (S17N). (i) Dystrybucja kbind dla eksperymentu w f. Odpowiednie szybkości kinetyczne zostały określone przy użyciu dopasowania krzywej jednoeksponencjalnej (linie ciągłe). (j) Drugi eksperyment z kontrolą negatywną z powierzchniowo zamocowanym FLAG-eGFP. (k) Rozkład kdiss dla eksperymentu w f. i kblinking dla eksperymentu w j. Odpowiednie szybkości kinetyczne zostały określone przy użyciu dopasowania do krzywej jednoeksponencjalnej (linie ciągłe). Słupki błędów oznaczają błąd standardowy (s.e.; n>200).

Aby wizualizować interakcję HRas-cRafRBD w czasie rzeczywistym na poziomie pojedynczej cząsteczki, połączyliśmy gen HRas z czerwonym białkiem fluorescencyjnym mCherry i połączyliśmy cRafRBD z ulepszonym zielonym białkiem fluorescencyjnym (eGFP; Fig. 1c). Ekspresję każdego z białek przeprowadziliśmy w osobnej grupie komórek HEK293. Zastosowaliśmy strategię single-molecule pull-down, aby unieruchomić mCherry-HRas na powierzchni2,3 (ryc. 1c). Następnie wstrzyknęliśmy drugi lizat całokomórkowy zawierający eGFP-cRafRBD na unieruchomioną powierzchnię mCherry-HRas, jak w konwencjonalnym co-IP (ryc. 1c). Użyliśmy mikroskopu z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIR) do wygenerowania ewanescencyjnego pola elektrycznego, które selektywnie wzbudzało eGFP-cRafRBD znajdujące się w odległości 100 nm od powierzchni. Aby zaobserwować słabe interakcje białko-białko, pojedyncze eGFP-cRafRBD przybywające na powierzchnię były monitorowane w czasie rzeczywistym z drugim lizatem całokomórkowym utrzymywanym w komorze (ryc. 1c).

Rycina 1f pokazuje typowy ślad w czasie rzeczywistym tego jednocząsteczkowego preparatu co-IP. Każdy ślad powstał przez integrację sygnału fluorescencji nad okrągłym obszarem zainteresowania (ROI) o powierzchni 1,1 μm2 (Rys. 1e). Kontrolowaliśmy gęstość powierzchniową mCherry-HRas, aby utrzymać średnio 0,5 cząsteczki HRas na ROI (Supplementary Fig. S4). Zastosowaliśmy również filtrowanie gaussowskie podczas integracji sygnału i rygorystyczny próg wykrywania sygnału, aby upewnić się, że ślady czasu rzeczywistego przedstawiają zdarzenia wiązania pojedynczych białek HRas (Rys. 1g i Uzupełniające Rys. S5). Każdy ślad czasu rzeczywistego wyraźnie składa się z dwóch części: fluorescencji tła i pojedynczych skoków fluorescencji. Każda cząsteczka eGFP-cRafRBD, poruszająca się zgodnie z ruchem Browna, powinna spędzić mniej niż 50 μs na jednej wizycie w warstwie wzbudzonej TIR. Ponieważ 50 μs jest trzy rzędy wielkości krótsze niż rozdzielczość czasowa naszej aparatury do obrazowania (50 ms), ruch Browna wielu cząsteczek eGFP-cRafRBD wytwarza stały poziom fluorescencji tła. Pojedyncze skoki fluorescencji, z drugiej strony, wskazują, że pojedynczy eGFP-cRafRBD oddziaływał z cząsteczką na powierzchni wystarczająco długo, aby przetrwać integrację sygnału 50 ms.

Następnie przeanalizowaliśmy istotną kinetykę tej interakcji białko-białko, analizując τoff, czas między zdarzeniami wiążącymi, i τon, czas trwania pojedynczego zdarzenia wiążącego (ryc. 1g). Dopasowując równania pojedynczego wykładnika do rozkładów τoff i τon otrzymano szybkości kinetyczne odpowiednio kbind i kdiss. Aby upewnić się, że skoki fluorescencji są rzeczywiście wynikiem specyficznej interakcji HRas-cRafRBD, przeprowadziliśmy ten sam eksperyment wiązania eGFP-cRafRBD z powierzchniowo zmobilizowanym dominująco ujemnym HRas (S17N), który ma zmniejszone powinowactwo do GTP14,15. W przypadku formy dominująco ujemnej, częstotliwość skoków fluorescencji (kbind) była znacznie zmniejszona (Rys. 1h). Ta negatywna kontrola dowodzi, że skoki fluorescencji nie są ani artefaktami prostej adsorpcji powierzchniowej eGFP-cRafRBD, ani nie wynikają z powierzchniowego unieruchomienia innych białek, które wywołują niepożądane interakcje eGFP-cRafRBD. Zamiast tego, te ślady fluorescencji spike wiernie raportują zdarzenia wiązania HRas-cRafRBD.

Wyjątkowe jest również to, że czas trwania pojedynczego zdarzenia wiązania typowo trwa tylko kilkaset ms (ryc. 1f). Zbadaliśmy dynamikę migania FLAG-eGFP16 unieruchomionego na powierzchni z przeciwciałem anty-FLAG (Rys. 1j). Fotoblondowanie FLAG-eGFP występuje średnio co kilka sekund, co daje szybkość kinetyczną mniejszą niż 0,3 s-1, a szybkość fotoblondowania eGFP jest o jeden rząd wielkości wolniejsza niż zmierzona przez nas kdiss (Rys. 1k). Co więcej, potwierdziliśmy wszystkie jednocząsteczkowe szybkości kinetyczne kbind i kdiss stosując kryterium kolokalizacji, które wymagało współlokalizacji sygnałów fluorescencyjnych z białek mCherry-HRas i eGFP-cRafRBD (Supplementary Fig. S6). Tak więc, interakcja HRas-cRafRBD musi rzeczywiście mieć szybki obrót, kilka razy na sekundę11,12.

Wizualizacja kompleksów napotkania w interakcji Ras-Raf

Szczegółowa analiza częstotliwości wiązania HRas-cRafRBD (kbind) wskazuje na istnienie szybkich, wstępnie wyrównujących się kompleksów napotkania17,18,19,20,21, które są luźnymi intermediatami interakcji białko-białko, które powinny być zaludnione przed utworzeniem ostatecznego kompleksu HRas-cRafRBD (ryc. 2). Gdy zwiększaliśmy stężenie eGFP-cRafRBD z 5 do 50 nM, kbind wykazywało paraboliczny wzrost (Rys. 2a), który można najlepiej dopasować do równania ze współczynnikiem Hilla (n) równym 1,1 (22,23), stałą dysocjacji (K1) równą 43 nM dla napotkanego kompleksu oraz κon równą 2.16 s-1 nM-1, która jest kinetyczną szybkością formowania końcowego stanu związanego z kompleksu napotykającego (Metody uzupełniające i Rys. uzupełniający S7). kdiss, z drugiej strony, jest w dużej mierze stała dla badanych przez nas stężeń eGFP-cRafRBD (Rys. 2b). Te szybkości kinetyczne zmierzone za pomocą naszego jednocząsteczkowego co-IP w czasie rzeczywistym są ściśle zgodne z wcześniejszymi doniesieniami przy użyciu masowych testów biochemicznych (Tabela Uzupełniająca S1). Należy zauważyć, że założyliśmy jedną dominującą konformację dla końcowego kompleksu HRas-cRafRBD. Chociaż nasze założenie jest potwierdzone przez jednomodalny rozkład intensywności spajków fluorescencji (Supplementary Fig. S8), nie możemy całkowicie wykluczyć możliwości, że istnieje wiele konformacji dla kompleksu HRas-cRafRBD z wieloma ścieżkami prowadzącymi do nich.

(a) kbind jako funkcja stężenia cRafRBD. Dla porównania pokazano liniowy wzrost kbind. (b) kdiss jako funkcja stężenia cRafRBD. Dla porównania pokazano kblinking z eksperymentu na Rys. 1j. Słupki błędów oznaczają s.e. (n>180). (c-e) Ślady interakcji HRas-cRafRBD w czasie rzeczywistym. Należy zauważyć, że fluorescencja tła wzrasta wraz z gęstością HRas na powierzchni. Użyliśmy tego samego stężenia ofiary =10 nM. (f) Wzrost fluorescencji tła jako funkcja gęstości powierzchniowej HRas. Trzy zestawy danych, uzyskane z 10 nM (czerwone kółka), 20 nM (zielone trójkąty) eGFP-cRafRBD i 20 nM rekombinowanego eGFP (niebieskie diamenty), są znormalizowane przez odpowiedni poziom fluorescencji tła mierzony przy niskiej gęstości powierzchniowej Ras wynoszącej 0,38 HRas na μm2. Słupki błędów oznaczają s.d. (n>100). (g) Częstotliwość spajków pojedynczej cząsteczki jako funkcja fluorescencji tła. Użyto zestawu danych uzyskanych przy 10 nM eGFP-cRafRBD. Słupki błędów oznaczają s.e. (n>100).

Remarkably, możemy wizualizować napotkane kompleksy poprzez zmianę gęstości powierzchniowej HRas. Gdyby fluorescencja tła była prostym produktem ruchu Browna eGFP-cRafRBD, zależałaby wyłącznie od stężenia cRafRBD w masie. Jednakże, fluorescencja tła gwałtownie wzrasta wraz z gęstością powierzchniową HRas, nawet jeśli stężenia cRafRBD są utrzymywane na stałym poziomie (Rys. 2c-f). Przy wysokiej gęstości Ras, wynoszącej 6,4 HRas na μm2, całkowita fluorescencja tła staje się trzykrotnie wyższa niż ta obserwowana przy 0,38 HRas na μm2 (Rys. 2c). Nasza symulacja numeryczna pokazuje, że obecność równoległych procesów wiążących w danym ROI może odpowiadać jedynie za mniej niż 5% obserwowanego wzrostu (Supplementary Fig. S9). Ponadto, gdy białka ofiarne zostały zmienione na rekombinowane eGFPs, które nie oddziaływały z powierzchniowo zmobilizowanymi białkami HRas, ich fluorescencja tła była zasadniczo niezmienna w badanym przez nas zakresie gęstości HRas (Rys. 2f, niebieskie diamenty). Tak więc, ponieważ mamy gęstą populację aktywnych HRas na powierzchni, wydaje się, że rzeczywiście jest więcej cząsteczek eGFP-cRafRBD pozostających nad powierzchnią, niż można by się spodziewać na podstawie czystej dyfuzji Browna. Te kompleksy spotkań powstają z szybkich, wstępnie wyrównujących się interakcji między HRas i białkami cRafRBD24, których dynamika jest poza naszą rozdzielczością czasową.

Następnie zapytaliśmy, czy kompleksy spotkań rzeczywiście służą jako substraty dla ostatecznego kompleksu HRas-cRafRBD. W tym celu ocenialiśmy częstotliwość skoków fluorescencji generowanych przez pojedyncze, immobilizowane powierzchniowo białko HRas. Rozumowaliśmy, że jeśli napotkane kompleksy są prawdziwe na pośrednich szlakach dla końcowego kompleksu Ras-Raf, częstotliwość pojedynczych cząsteczek spajków powinna rosnąć wraz ze wzrostem fluorescencji tła, pomimo tego samego stężenia cRafRBD w masie. Aby uzyskać częstotliwość spajków jednocząsteczkowych w środowiskach gęstych HRas, zmierzyliśmy kbind używając mniejszego ROI 3 na 3 piksele (0,18 μm2) i podzieliliśmy zmierzoną wartość kbind przez średnią liczbę HRas w każdym ROI 3 na 3 piksele (Supplementary Fig. S10). Ogólnie rzecz biorąc, ta częstotliwość pojedynczych cząsteczek spike wzrosła wraz z fluorescencją tła (Fig. 2g, użyto 10 nM eGFP-cRafRBD). Nasza obserwacja sugeruje, że skoncentrowane białka downstream w postaci kompleksów napotykających prowadzą do tworzenia kompleksu Ras-Raf ze zwiększoną częstotliwością.

Single-molecule co-IP analysis of signalling proteins in cancers

Do tej pory zademonstrowaliśmy pomiar w czasie rzeczywistym kinetyki interakcji białko-białko podczas single-molecule co-IP. W tych eksperymentach, jednakże, białka przynęty i ofiary są połączone z białkowymi znacznikami fluorescencyjnymi, co stawia pytanie, czy możemy rozszerzyć tę technikę na białka natywne. W tym celu dokonaliśmy ekspresji zmutowanego HRas (G12V) w nienowotworowej ludzkiej linii komórek nabłonka piersi (MCF10A), aby przekształcić je w komórki nowotworowe25 (ryc. 3a). Te przekształcone komórki, które wykazywały wzrost bez surowicy (Supplementary Fig. S11), tworzyły guzy po wstrzyknięciu do opuszki tłuszczowej sutka myszy z obniżoną odpornością (Fig. 3b). Tkanki nowotworowe uzyskano 17 dni po ksenograftach, a tkanki kontrolne przygotowano z tych samych części nieleczonych myszy nagich.

(a,b) Transformacja komórek MCF10A w komórki nowotworowe przez transdukcję retrowirusową HRas (G12V). Ta jednopunktowa mutacja jest znana z tego, że czyni HRas konstytutywnie aktywnym. Wstrzyknięcie komórek nowotworowych do opuszki sutka myszy nago prowadzi do powstania guza. Pasek skali, 5 mm. (c) Schemat jednomolekularnej analizy western blot. Konkurencja między komórkowym i sondą Ras o wiązanie z pierwotnym przeciwciałem zmniejsza liczbę sond Ras specyficznie związanych z powierzchnią, co w konsekwencji zmniejsza liczbę plamek fluorescencyjnych. Należy zauważyć, że ponieważ każde pierwotne przeciwciało wiąże się z dwoma białkami Ras, jedna plamka fluorescencyjna znika, gdy oba ramiona łańcucha lekkiego są zajęte przez komórkowy Ras. (d) Prototypowy jednomolekularny pomiar western blot. Jako białko docelowe użyto 298 nM mCherry-HRas. Przy 32,5 nM eGFP-HRas jako sondzie, stężenie białka docelowego wynosiło 288±1,4 nM. Pasek błędów oznacza s.d. (n=20). (e) Poziom ekspresji Ras mierzony w procesie nowotworzenia od a,b. Słupki błędów oznaczają s.d. (n=20). (f) Schemat obrazowania co-IP w czasie rzeczywistym dla natywnego HRas. (g-j) Ślady obrazowania co-IP w czasie rzeczywistym. Stężenia HRas użyte do pull down to 3,0 (g), 41,3 (h), 3,5 (i) i 49 nM (j). Częstość skoków fluorescencji była znacząco zwiększona dla ekstraktu tkanki nowotworowej, gdy HRas pull-down został zwiększony z 1,6 do 22 HRas na μm2 (g versus h). Nie zaobserwowano tego w przypadku kontrolnego ekstraktu tkankowego (i versus j). (k) Schemat inflacji kbind. W warunkach rzadkiego występowania aktywnych przynęt na powierzchni, uzyskuje się stałe, jednocząsteczkowe wiązanie kbind, nawet gdy powierzchnia przynęt jest zwiększona (lewe dwa panele). Jednakże, po przekroczeniu progu 0.6 aktywnych przynęt na μm2, więcej niż jedna przynęta jest obecna średnio na ROI. Te liczne przynęty powodują wzrost kbind mierzonego z każdego ROI (prawy panel). (l) kbind jako funkcja HRas pull-down. Słupki błędów oznaczają s.e. (n>180).

Dążąc do ilościowego opisania tego procesu nowotworzenia, użyliśmy tandemowych warstw przeciwciał; biotynilowane powierzchniowo przeciwciało drugorzędowe i specyficzne dla Ras przeciwciało pierwszorzędowe1,2. Umożliwiło to wychwycenie natywnego, nieznakowanego Ras, jak również znakowanego Ras (Rys. 3c). Najpierw prześledziliśmy ilościowo poziomy ekspresji Ras w procesie nowotworzenia. Ekstrakty komórkowe lub tkankowe mieszano z rozcieńczonym lizatem komórek HEK293, który zawierał sondę Ras (eGFP-HRas) o znanym stężeniu. W warunkach reakcji, które w pełni nasycają miejsca wiązania przeciwciała pierwotnego, takie mieszanie prowadzi do konkurencji o wiązanie przeciwciała specyficznego dla Ras między sondą Ras a docelowym komórkowym Ras (Rys. 3c, po lewej). Liczba cząsteczek sondy Ras związanych z przeciwciałami pierwszorzędowymi spada wraz ze wzrostem stężenia docelowego komórkowego Ras. To konkurencyjne wiązanie zmniejsza liczbę plamek fluorescencji na powierzchni (Rys. 3c, po prawej), co jest zgodne z równaniem przy normalizacji do stanu wiązania tylko z sondą Ras (Uzupełniające Rys. S12). Mierząc liczbę związanych cząsteczek sondy w kilku różnych rozcieńczeniach, byliśmy w stanie specyficznie i solidnie zmierzyć stężenie molowe docelowego komórkowego Ras w ekstraktach komórek i tkanek (Fig. 3d i Supplementary Fig. S12). Ta jednocząsteczkowa analiza western blot wykazała poziomy ekspresji Ras wynoszące 42 i 59 nM w ekstraktach 1 mg ml-1 odpowiednio z nowotworowych komórek MCF10A i tkanek nowotworowych ksenograftów, podczas gdy poziom podstawowy 7 nM został zmierzony w ekstraktach 1 mg ml-1 tkanki kontrolnej (Fig. 3e).

Co więcej, byliśmy również w stanie odtworzyć w czasie rzeczywistym jednocząsteczkowe obrazowanie co-IP z Fig. 1 i 2 na tej natywnej powierzchni wychwytującej Ras. Po ściągnięciu HRas z ekstraktów tkanek nowotworowych lub kontrolnych na powierzchnię przeciwciała tandemowego, zastosowaliśmy lizat komórkowy sondy, rozcieńczony lizat komórkowy HEK293 z białkami prey o masie 20 nM eGFP-cRafRBD (Fig. 3f). Przeanalizowaliśmy ślady co-IP w czasie rzeczywistym w celu określenia szybkości kinetycznych kbind i kdiss (Rys. 3g-j). Należy zauważyć, że informacje o stężeniu pochodzące z jednocząsteczkowej analizy western blot (Rys. 3e) były kluczowe dla zapewnienia określonego stężenia HRas dla każdego pull down, gdy ekstrakty tkanki nowotworowej i kontrolnej miały różne poziomy ekspresji HRas. Korzystając z danych kalibracyjnych dla powierzchniowego pull down (Supplementary Fig. S13), informacje o stężeniu zostały ostatecznie przekształcone w określoną gęstość powierzchniową ściąganych białek HRas (Fig. 3g-j).

Systematycznie badaliśmy zmianę kbind podczas precyzyjnego zwiększania gęstości powierzchniowej ściąganych białek HRas (Fig. 3k). Zakładamy, że w wyniku regulacji komórkowej, tylko podzbiór białek HRas na powierzchni powinien być w stanie GTP-loaded i wykazywać aktywne zdarzenia wiążące z białkami ofiarnymi. W warunkach rozproszenia, w których odległość między sąsiednimi aktywnymi cząsteczkami HRas jest znacznie większa niż średnica każdego ROI, obserwowana kinetyka z każdego ROI powinna być niezależna od całkowitego unieruchomienia HRas na powierzchni i po prostu raportować aktywność pojedynczych białek HRas (Rys. 3k, lewe dwa panele i Supplementary Fig. S14). Ponieważ powierzchnia staje się bardziej zatłoczona aktywnymi HRas, powinien istnieć próg, przy którym zaczyna być więcej niż jedna aktywna cząsteczka HRas na ROI. Po przekroczeniu tego progu, dodatkowe aktywne cząsteczki HRas w każdym ROI wytworzyłyby dodatkowe skoki fluorescencji, które w konsekwencji spowodowałyby nadmuchanie kbind (Fig. 3k, prawy panel i Supplementary Fig. S14). Rzeczywiście, zaobserwowaliśmy taki dwufazowy trend kbind dla tkanki nowotworowej, z progiem przy ~ 3 HRas ściągniętych na μm2 (Fig. 3l).

Tak więc, poniżej progu dla inflacji kbind, obserwowana kinetyka spajków w dużej mierze odzwierciedlałaby aktywność pojedynczych cząsteczek HRas. Warto zauważyć, że przy 1,6-1,9 HRas ściąganych na μm2 , podobne wartości kbind wynoszące 0,28 s-1 i 0,22 s-1 zaobserwowano odpowiednio dla białek HRas pochodzących z guza i tkanki kontrolnej (Rys. 3l). Pomiary kdiss były również bardzo podobne przy 2,5 s-1 (Supplementary Fig. S15). Pochodząca z guza pojedyncza-onkogenna HRas miała w konsekwencji pozorną stałą dysocjacji 180 nM i była ona bardzo podobna do stałej dysocjacji 230 nM dla aktywnej HRas z ekstraktu tkanki kontrolnej. Nasze obserwacje wskazują na istotny fakt, że aktywność jednocząsteczkowa onkogennej HRas nie różni się dramatycznie od aktywności aktywowanej HRas typu dzikiego.

Co zatem odróżnia ten stan nowotworowy od stanu normalnego? Próg dla inflacji kbind pozwala nam na ilościowe określenie innej ważnej statystyki białek sygnalizacji komórkowej, proporcji białek HRas aktywnie wiążących się z cRafRBD. Intuicyjnie, próg dla inflacji kbind powinien odpowiadać określonej gęstości powierzchniowej „aktywnych” białek przynętowych. W naszym schemacie obrazowania próg ten ustalono na poziomie 0,6 aktywnych białek przynętowych na μm2, co nie zależy od szczegółowych typów białek przynętowych i ofiarnych (Supplementary Fig. S13). Ponieważ próg dla inflacji kbind zaobserwowano przy całkowitej liczbie 3 HRas ściąganych na μm2, frakcja aktywnych HRas została bezpośrednio oszacowana na około 20% dla tkanki nowotworowej. W przeciwieństwie do tego, nie byliśmy w stanie zaobserwować inflacji wiązania kb, gdy nawet 25 białek HRas zostało ściągniętych na μm2 z tkanki kontrolnej (Rys. 3l). Te obserwacje wskazują, że onkogenny HRas pochodzący z tkanki nowotworowej ma wyższą aktywną frakcję niż HRas pochodzący z tkanki kontrolnej o jeden rząd wielkości.

W końcu zapytaliśmy, czy ta wyższa proporcja aktywnego Ras może być prostą konsekwencją nadekspresji HRas w ksenograftowanym guzie. Nadekspresja białek HRas mogła przewyższać liczbę potencjalnych partnerów wiążących, co pozostawało dostępne dla wiązania z Raf znakowanym eGFP. Aby bezpośrednio odpowiedzieć na to pytanie, przetestowaliśmy dwie linie komórkowe ludzkiego raka piersi, MCF-7, która ma KRas typu dzikiego i MDA-MB-231, która ma zmutowaną formę KRas (G13D; ryc. 4). W szczególności, wiadomo, że komórki MDA-MB-231 wykazują uzależnienie od onkogenu zmutowanego genu KRas, a ich przeżycie w znacznym stopniu zależy od nieprawidłowej sygnalizacji KRas26,27. Wykorzystując te dwie linie komórkowe, jesteśmy również w stanie określić, czy nasze metody mają zastosowanie do sygnalizacji KRas, która ma zasadnicze znaczenie w diagnostyce molekularnej i leczeniu wielu ludzkich nowotworów28.

(a,b) Single-molecule western blot analyses of KRas expression levels. eGFP-labelled KRas was used as the probe Ras. Poziom ekspresji KRas typu dzikiego w linii MCF-7 został zmierzony do 17.3±1.3 nM, podczas gdy poziom ekspresji KRas mutanta G13D w linii MDA-MB-231 został zmierzony do 5.5±0.3 nM na 1 mg ml-1 ekstraktów. Słupki błędów oznaczają s.d. (n=200). (c) kbind jako funkcja pull down KRas. Zwraca uwagę ta sama wartość kbind wspólna dla dzikiego typu i zmutowanego KRas w regionie kinetyki pojedynczej cząsteczki (wspólna płaska linia). Próg dla kbind został zmierzony na poziomie 1,2 ściągniętej KRas na μm2 dla zmutowanej KRas z MDA-MB-231, co dało szacunkową aktywną frakcję 50%. Wartość ta była o rząd wielkości wyższa niż 6% dla dzikiej KRas z MCF-7, dla której próg wynosił 10 KRas pull down na μm2. Słupki błędów oznaczają s.e. (n>150).

Bezpośrednio ściągnęliśmy KRas z tych ekstraktów komórkowych przy użyciu specyficznego dla KRas przeciwciała pierwotnego. Nasza jednomolekułowa analiza western blot wykazała, że dziki typ KRas w komórkach MCF-7 ma wyższe stężenie (17 nM) niż zmutowany KRas w komórkach MDA-MB-231 (5,5 nM w ekstraktach 1 mg ml-1; Fig. 4a i Supplementary Fig. S16). Biorąc pod uwagę uzależnienie komórek MDA-MB-231 od onkogenu KRas, ich mniejszy poziom ekspresji KRas był dość nieoczekiwaną obserwacją. Co więcej, kinetyka sygnalizacji w pojedynczych cząsteczkach dla dzikiego typu i zmutowanego KRas jest zasadniczo taka sama (ryc. 4c, wspólna płaska linia; patrz Suplementary Fig. S15 dla kdiss). Z drugiej strony, nasze jednocząsteczkowe co-IP w czasie rzeczywistym rozstrzyga, że próg dla inflacji wiązania kb dla zmutowanej KRas z MDA-MB-231 jest zidentyfikowany na poziomie 1,2 KRas ściąganej na μm2, podczas gdy próg ten jest obserwowany na poziomie ~10 KRas ściąganych na μm2 dla dzikiej KRas z MCF-7 (Rys. 4c). Ponieważ inflacja kbind zawsze występuje przy 0,6 aktywnych przynęt na μm2, te rozbieżne progi bezpośrednio wskazują, że aktywna frakcja zmutowanej KRas, która silnie wiąże się z jej celem (15 nM cRafRBD) wynosi 50%, prawie o rząd wielkości więcej niż 6% wykazywane przez dziką KRas. Tak więc, wyższa aktywna frakcja wykazywana przez onkogennego mutanta Ras wyraźnie nie jest artefaktem nadekspresji, ponieważ mutant KRas był wyrażany na niższych poziomach, ale wykazywał wyższą aktywną frakcję niż dziki typ.

.