Real-time beeldvorming van single-molecule co-IP
Wij tonen eerst aan dat de kinetiek van een eiwit-eiwit interactie kan worden gemeten in celextracten op het single-molecule niveau (Fig. 1). Als modelinteractie in een celsignaleringsroute kozen we de interactie tussen Ras en Raf, die de eerste stap vormt van de geconserveerde MAPK-route die in veel humane kankers hypergeactiveerd is5,6,7. We hebben gebruik gemaakt van het Ras-bindende domein van cRaf (cRafRBD) en een versie van HRas met een eenpuntsmutatie, Q61L, die het constitutief actief maakt6,8,9,10,11,12. Live cell beeldvorming van HeLa cellen co-expressie van deze twee eiwitten toonde een hoog niveau van co-lokalisatie (Fig. 1a en Supplementary Fig. S2). We waren in staat om deze co-lokalisatie te leiden met rapamycine-getriggerde translocatie van HRas naar het plasmamembraan13, wat resulteerde in gelijktijdige lokalisatie van cRafRBD op dezelfde plaatsen. De conventionele co-IP produceerde ook een duidelijke westerse band, wat wijst op een selectieve eiwit-eiwit interactie tussen constitutief actieve HRas en cRafRBD (Fig. 1b, links). We ontdekten echter dat deze schijnbaar duidelijke eiwitband slechts minder dan 5% van de volledige prooi-eiwitten bevatte, wat suggereert dat de prooi-eiwitten mogelijk niet stabiel aan aas zijn gebonden, maar zijn verwijderd naar het doorstroomde gedeelte door wasprocessen (Fig. 1b, rechts en supplementaire Fig. S3). We merken verder op dat zowel van de levende cel beeldvorming en co-IP benaderingen niet kan ontleden de echte kinetiek van deze misschien zwak, voorbijgaande eiwit-eiwit interactie.
(a) Live cell co-lokalisatie studie voor de HRas-cRafRBD interactie. Eiwit-eiwit interacties tussen HRas en cRafRBD werden beoordeeld door de translocatie van cRafRBD naar het plasmamembraan samen met HRas waar te nemen. CA en DN duiden op de constitutief actieve en dominant negatieve vormen van HRas, respectievelijk. Schaal bar, 10 pm. (b) Conventionele co-IP gegevens voor de HRas-cRafRBD interactie. Voor de co-IP analyses, GST-cRafRBD (links) en mCherry-HRas eiwitten (rechts) werden gebruikt, respectievelijk, als de baits geïmmobiliseerd op kralen. (c) Schematische weergave van de real-time single-molecule co-IP. (d) TIRF beeld van geïmmobiliseerde mCherry-HRas op het oppervlak. Schaal bar, 10 pm. (e) Opeenvolgende frames van real-time beeldvorming van single-molecule co-IP. De real-time spoor van deze binding gebeurtenissen wordt getoond in f en gemarkeerd met een rood vierkant. Schaal bar, 1 um. (f, g) Voorbeeld van real-time sporen van de real-time single-molecuul co-IP beeldvorming. Het signaal bestaat voornamelijk uit een diffuse achtergrond fluorescentie gesuperponeerd met een opeenvolging van fluorescentie pieken. (h) Een negatieve controle experiment met oppervlak-gemobiliseerde DN HRas (S17N). (i) Distributie kbind voor het experiment in f. Relevante kinetische tarieven werden bepaald met behulp van een single-exponentiële curve fit (ononderbroken lijnen). (j) Een tweede negatieve controle experiment met oppervlakte-gemobiliseerde FLAG-eGFP. (k) Verdeling van kdiss voor het experiment in f. En kblinking voor het experiment in j. Relevante kinetische snelheden werden bepaald met behulp van een single-exponentiële curve fit (ononderbroken lijnen). Foutbalken geven de standaard fout (s.e.; n>200).
Om de HRas-cRafRBD interactie te visualiseren in real-time op de single-molecuul niveau, hebben we gefuseerd de HRas-gen met het rode fluorescerende eiwit mCherry en we gefuseerd cRafRBD met enhanced green fluorescent protein (eGFP; Fig. 1c). We brachten elk eiwit tot expressie in een aparte groep van HEK293 cellen. We gebruikten de strategie van single-molecule pull-down te immobiliseren mCherry-HRas op het oppervlak 2,3 (Fig. 1c). Vervolgens injecteerden we het tweede hele-cellysaat met eGFP-cRafRBD op het mCherry-HRas geïmmobiliseerde oppervlak zoals in een conventionele co-IP (Fig. 1c). We gebruikten een totale interne reflectie (TIR) microscoop op een evanescent elektrisch veld dat selectief opgewonden eGFP-cRafRBDs die binnen 100 nm van het oppervlak te genereren. Om zwakke eiwit-eiwit interacties te observeren, werden enkele eGFP-cRafRBD aankomsten op het oppervlak gecontroleerd in real-time met de tweede hele cel lysaat gehandhaafd in de kamer (Fig. 1c).
Figure 1f toont een typische real-time spoor van deze single-molecule co-IP voorbereiding. Elk spoor werd geproduceerd door de integratie van de fluorescentie signaal over een cirkelvormig gebied van belang (ROI) met een oppervlakte van 1,1 urnm2 (Fig. 1e). We controleerden het oppervlak dichtheid van mCherry-HRas tot een gemiddelde van 0,5 HRas molecuul per ROI (Supplementary Fig. S4) te handhaven. We gebruikten ook Gaussiaanse filtering tijdens de signaalintegratie en een strenge drempel voor signaaldetectie om ervoor te zorgen dat de real-time sporen de binding gebeurtenissen van single-HRas eiwitten (Fig. 1g en Supplementary Fig. S5) gemeld. Elke real-time spoor bestaat duidelijk uit twee delen: een achtergrond fluorescentie en individuele fluorescentie pieken. Elke eGFP-cRafRBD molecuul, bewegende volgens Brownse beweging, moet besteden minder dan 50 u per bezoek aan de TIR excitatie laag. Aangezien 50 urn is drie orden van grootte korter dan de tijd resolutie van onze imaging-apparatuur (50 ms), de Brownse beweging van veel eGFP-cRafRBD moleculen produceren een constant niveau voor achtergrondfluorescentie. De individuele fluorescentie pieken, aan de andere kant, geven aan dat een enkele eGFP-cRafRBD heeft gereageerd met een molecuul op het oppervlak lang genoeg om de 50 ms signaalintegratie overleven.
We analyseerden vervolgens de essentiële kinetiek van dit eiwit-eiwit interactie door het analyseren van τoff, de tijd tussen bindende gebeurtenissen, en τon, de duur van een enkele-bindende gebeurtenis (Fig. 1g). Montage enkele exponentiële vergelijkingen met de τoff en τon distributies geeft de kinetische tarieven van kbind en kdiss, respectievelijk. Om ervoor te zorgen dat de fluorescentie pieken inderdaad het gevolg zijn van een specifieke HRas-cRafRBD interactie, voerden we dezelfde eGFP-cRafRBD binding experiment met oppervlak-gemobiliseerde dominant negatieve HRas (S17N), die een verminderde affiniteit tot GTP 14,15 heeft. Met de dominant negatieve vorm, de fluorescentie piekfrequentie (kbind) was sterk verminderd (Fig. 1h). Deze negatieve controle bewijst dat de fluorescentiepieken geen artefacten zijn van eenvoudige eGFP-cRafRBD oppervlakte-adsorptie, noch zijn ze het gevolg van oppervlakte-immobilisatie van andere eiwitten met valse eGFP-cRafRBD interacties. In plaats daarvan, deze fluorescentie spike sporen trouw verslag van de HRas-cRafRBD binding events.
Het is ook opmerkelijk dat de duur van een enkele-binding gebeurtenis duurt meestal slechts een paar honderd ms (Fig. 1f). We bestudeerden de knipperende dynamiek van FLAG-eGFP16 geïmmobiliseerd aan een oppervlak met een anti-FLAG antilichaam (Fig. 1j). Het fotoverknipperen van FLAG-eGFP gebeurt gemiddeld om de paar seconden, wat een kinetische snelheid oplevert kleiner dan 0,3 s-1, en deze eGFP fotoverknipperingssnelheid is een orde van grootte trager dan de kdiss die we gemeten hebben (Fig. 1k). Bovendien hebben we gevalideerd alle single-molecule kinetische tarieven van kbind en kdiss met behulp van een co-lokalisatie criterium dat co-lokatie van fluorescentiesignalen van de mCherry-HRas en eGFP-cRafRBD eiwitten (Supplementary Fig. S6) vereist. Zo moet de HRas-cRafRBD interactie inderdaad een snelle omzet, een paar keer per seconde 11,12.
Visualisatie van ontmoeting complexen in Ras-Raf interactie
Gedetailleerde analyse van de HRas-cRafRBD bindingsfrequentie (kbind) geeft het bestaan van snelle pre-equilibrerende ontmoeting complexen 17,18,19,20,21, die losse eiwit-eiwit interactie tussenproducten die moeten worden bevolkt vóór de vorming van de uiteindelijke HRas-cRafRBD complex (Fig. 2). Toen we de concentratie van eGFP-cRafRBD van 5 tot 50 nM verhoogden, vertoonde de kbind een parabolische toename (Fig. 2a), die het best past in de vergelijking van 
met een Hill coëfficiënt (n) van 1,1 (22,23), een dissociatieconstante (K1) van 43 nM voor ontmoeting complexvorming, en een κon van 2.16 s-1 nM-1, dat is de kinetische snelheid van de vorming van de uiteindelijke gebonden toestand van een ontmoeting complex (Supplementary Methods en Supplementary Fig. S7). kdiss, aan de andere kant, is grotendeels constant voor de eGFP-cRafRBD concentraties die we bestudeerden (Fig. 2b). Deze kinetische snelheden gemeten met onze real-time single-molecule co-IP zijn nauw in overeenstemming met eerdere rapporten met behulp van bulk biochemische assays (Supplementary Table S1). Een opmerking is dat we zijn uitgegaan van een overheersende conformatie voor de uiteindelijke HRas-cRafRBD complex. Hoewel onze veronderstelling wordt bevestigd door de unimodale verdeling van de fluorescentie piek intensiteit (Supplementary Fig. S8), kunnen we niet volledig uitsluiten dat er meerdere conformaties voor de HRas-cRafRBD complex met meerdere paden leidt tot hen.
(a) kbind als functie van de cRafRBD concentratie. Ter vergelijking wordt een lineaire toename van kbind getoond. (b) kdiss als functie van de cRafRBD-concentratie. kblinking uit het experiment in Fig. 1j wordt ter vergelijking getoond. Foutbalkjes geven s.e. aan (n>180). (c-e) Real-time sporen van HRas-cRafRBD interactie. Merk op dat de achtergrond fluorescentie toeneemt met het oppervlak HRas dichtheid. We gebruikten dezelfde prooi concentratie van = 10 nM. (f) Achtergrond fluorescentie toename als functie van het oppervlak HRas dichtheid. Drie datasets, verkregen met 10 nM (rode cirkels), 20 nM (groene driehoeken) eGFP-cRafRBD en 20 nM recombinant eGFP (blauwe diamanten), zijn genormaliseerd met de overeenkomstige achtergrond fluorescentie niveau gemeten bij een laag oppervlak Ras dichtheid van 0,38 HRas per umm2. Foutbalken geven s.d. (n>100). (g) Single-molecuul spike frequentie als functie van de achtergrond fluorescentie. De dataset verkregen met 10 nM eGFP-cRafRBD wordt gebruikt. Foutbalken geven s.e. (n>100).
Merkelijk kunnen we de ontmoeting complexen visualiseren door het variëren van de oppervlakte dichtheid van HRas. Als de achtergrondfluorescentie een eenvoudig product is van de Brownse beweging van eGFP-cRafRBD, zou deze alleen afhangen van de bulkconcentratie van cRafRBD. Echter, de achtergrond fluorescentie sterk toeneemt met het oppervlak dichtheid van HRas, ook al zijn de cRafRBD concentraties constant gehouden (Fig. 2c-f). Bij een hoge Ras dichtheid van 6,4 HRas per um2, de totale achtergrond fluorescentie wordt drie keer zo hoog als die waargenomen bij 0,38 HRas per um2 (Fig. 2c). Onze numerieke simulatie toont aan dat de aanwezigheid van parallelle binding processen in een bepaalde ROI kan slechts goed zijn voor minder dan 5% van de waargenomen stijging (Supplementary Fig. S9). Bovendien, wanneer de prooi eiwitten werden gewijzigd in recombinant eGFP’s, die niet interageren met oppervlak-geïmmobiliseerde HRas eiwitten, hun achtergrond fluorescentie was in wezen onveranderlijk in de HRas dichtheid bereik dat we bestudeerden (Fig. 2f, blauwe diamanten). Dus, als we een dichte bevolking van actieve HRas op het oppervlak, lijkt er inderdaad meer eGFP-cRafRBD moleculen blijven hangen boven het oppervlak dan zou worden verwacht door pure Brownse diffusie. Deze ontmoeting complexen ontstaan uit snelle pre-equilibrerende interacties tussen HRas en cRafRBD eiwitten24, waarvan de dynamiek is buiten onze temporele resolutie.
We vroegen ons vervolgens af of de ontmoeting complexen inderdaad dienen als substraten voor de uiteindelijke HRas-cRafRBD complex. Daartoe hebben we de frequentie van fluorescentie pieken gegenereerd door een enkel oppervlak-gemobiliseerd HRas eiwit. We hebben geredeneerd dat als de ontmoeting complexen zijn waar op pathway tussenproducten voor de uiteindelijke Ras-Raf complex, de single-molecuul spike frequentie moet groeien met de toenemende achtergrond fluorescentie, ondanks de dezelfde bulk cRafRBD concentratie. Om de single-molecule spike frequentie in HRas-dichte omgevingen te verkrijgen, hebben we gemeten kbind met behulp van een kleinere 3 bij 3 pixel ROI (0,18 um2) en de gemeten kbind waarde gedeeld door het gemiddelde aantal HRas in elke 3 bij 3 pixel ROI (Supplementary Fig. S10). In grote lijnen, deze single-molecuul spike frequentie steeg met de achtergrond fluorescentie (Fig. 2g, 10 nM eGFP-cRafRBD gebruikt). Onze waarneming suggereert dat de geconcentreerde downstream-eiwitten in de vorm van ontmoeting complexen leiden tot de vorming van het Ras-Raf complex met een verhoogde frequentie.
Single-molecule co-IP analyse van signaleringseiwitten in kankers
Wij hebben tot nu toe aangetoond dat de real-time meting van eiwit-eiwit interactie kinetiek tijdens single-molecule co-IP. In deze experimenten, echter, de bait en prooi eiwitten zijn gefuseerd met fluorescerende eiwitten tags, waardoor de vraag of we deze techniek kunnen uitbreiden tot natieve eiwitten. Daartoe hebben we tot expressie gemuteerde HRas (G12V) in een niet-tumorigene humane borst epitheelcellijn (MCF10A) om ze te transformeren tot kankercellen 25 (Fig. 3a). Deze getransformeerde cellen, die serumvrije groei vertoonden (Supplementary Fig. S11), vormden tumoren wanneer geïnjecteerd in de borst vet pad van immuno-gecompromitteerde muizen (Fig. 3b). Tumorweefsels werden verkregen 17 dagen na de xenograft, en controleweefsels werden bereid uit dezelfde delen van onbehandelde naakte muizen.
(a,b) Transformatie van MCF10A-cellen in kankercellen door retrovirale HRas (G12V)-transductie. Het is bekend dat deze éénpuntsmutatie HRas constitutief actief maakt. Injectie van kankercellen in de borstklier van naakte muizen leidt tot tumorvorming. Schaal bar, 5 mm. (c) Schema van single-molecule western blot analyse. Concurrentie tussen cellulaire en probe Ras voor binding aan het primaire antilichaam vermindert het aantal probe Ras specifiek gebonden aan het oppervlak, die bijgevolg vermindert het aantal fluorescerende vlekken. Merk op dat als elk primair antilichaam zich bindt aan twee Ras-eiwitten, één fluorescerende vlek verdwijnt als beide van de twee lichte-keten armen bezet zijn door cellulaire Ras. (d) Prototypische single-molecule western blot meting. 298 nM mCherry-HRas werd gebruikt als doeleiwit. Met 32,5 nM eGFP-HRas als de probe, werd de doeleiwitconcentratie gemeten op 288±1,4 nM. De foutbalk is s.d. (n=20). (e) Ras expressie niveaus gemeten door het proces van tumorigenese van a,b. Foutbalkjes geven s.d. aan (n=20). (f) Schematische van real-time co-IP beeldvorming voor native HRas. (g-j) Real-time sporen van co-IP beeldvorming. De HRas concentraties gebruikt voor pull-down zijn 3,0 (g), 41,3 (h), 3,5 (i) en 49 nM (j). De frequentie van fluorescentie pieken werd aanzienlijk verhoogd voor de kankerweefsel extract wanneer HRas pull-down werd verhoogd van 1,6 tot 22 HRas per pm2 (g versus h). Dit werd niet waargenomen met de controle weefsel extract (i versus j). (k) Schema van kbind inflatie. Onder schaarse omstandigheden van actieve baits op het oppervlak, een constante, single-molecule kbind wordt verkregen, zelfs wanneer het oppervlak pull-down van baits wordt verhoogd (links twee panelen). Echter, voorbij de drempel bij 0,6 actieve baits per um2, meer dan een baits aanwezig zijn per ROI gemiddeld. Deze meerdere baits hebben het effect van het verhogen van kbind gemeten uit elke ROI (rechter paneel). (l) kbind als een functie van HRas pull-down. Foutbalken geven s.e. (n>180).
In een poging om deze tumorigenese kwantitatief beschrijven, gebruikten we tandem lagen van antilichamen; een oppervlakte-gemobiliseerde gebiotinyleerd secundair antilichaam en een Ras-specifiek primair antilichaam 1,2. Dit maakt het mogelijk om zowel natief, ongelabeld Ras als gelabeld Ras vast te leggen (Fig. 3c). We volgden eerst de expressie van Ras kwantitatief gedurende het proces van tumorigenese. Cel- of weefselextracten werden gemengd met een verdund HEK293 cellysaat, dat probe Ras (eGFP-HRas) van bekende concentratie bevatte. Onder de reactiecondities waarbij de bindingsplaatsen van het primaire antilichaam volledig verzadigd zijn, leidt deze menging tot een competitie voor Ras-specifiek antilichaam binding tussen de probe Ras en doelwit cellulair Ras (Fig. 3c, links). Het aantal probe Ras moleculen gebonden aan de primaire antilichamen daalt naarmate de concentratie van het doelwit Ras toeneemt. Deze competitieve binding vermindert het aantal fluorescentie vlekken op het oppervlak (Fig. 3c, rechts), die de vergelijking volgt van 
wanneer genormaliseerd naar een probe Ras-only binding voorwaarde (Supplementary Fig. S12). Door het meten van het aantal gebonden probe moleculen bij verschillende verdunningen, waren we in staat om specifiek en robuust de molaire concentratie van doelwit cellulaire Ras te meten in cel- en weefselextracten (Fig. 3d en Supplementary Fig. S12). Deze single-molecule western blot analyse gaf Ras expressie niveaus van 42 en 59 nM in 1 mg ml-1 extracten van de kankerachtige MCF10A cellen en xenograft tumorweefsels, respectievelijk, terwijl een basislijn niveau van 7 nM werd gemeten in 1 mg ml-1 extracten van het controleweefsel (Fig. 3e).
Daarnaast waren we ook in staat om de real-time single-molecule co-IP beeldvorming van Figs. 1 en 2 te repliceren op deze natieve Ras-capturing oppervlak. Na het omlaag trekken van HRas van tumor- of controleweefselextracten op het tandem-antilichaamoppervlak, brachten we een probe-cellysaat aan, een verdund HEK293-cellysaat met 20 nM eGFP-cRafRBD-prooi eiwitten (Fig. 3f). We analyseerden real-time co-IP sporen om de kinetische snelheden kbind en kdiss te bepalen (Fig. 3g-j). Het is belangrijk op te merken dat de concentratie informatie van de single-molecule western blot analyse (Fig. 3e) was van cruciaal belang om een bepaalde HRas concentratie voor elke pull-down wanneer de tumor en controle weefselextracten hadden verschillende HRas expressie niveaus te garanderen. Met behulp van de kalibratiegegevens voor oppervlakte pull-down (Supplementary Fig. S13), werd de concentratie-informatie uiteindelijk omgezet in een specifieke oppervlaktedichtheid van pull-down HRas-eiwitten (Fig. 3g-j).
We bestudeerden systematisch de verandering in kbind terwijl precies het verhogen van de oppervlaktedichtheid van pull-down HRas-eiwitten (Fig. 3k). We veronderstellen dat als gevolg van cellulaire regulering, slechts een subset van HRas eiwitten op het oppervlak moet in de GTP-geladen toestand en tonen actieve binding gebeurtenissen met de prooi eiwitten. Onder een schaarse voorwaarde waarin de afstand tussen naburige actieve HRas moleculen is veel groter dan de diameter van elke ROI, de waargenomen kinetiek van elke ROI moet onafhankelijk zijn van de totale HRas oppervlak immobilisatie en gewoon verslag van de activiteit van enkele-HRas eiwitten (Fig. 3k, links twee panelen en Supplementary Fig. S14). Naarmate het oppervlak wordt meer bevolkt met actieve HRas, moet er een drempel waarbij er begint te meer dan een actieve HRas moleculen per ROI. Zodra voorbij deze drempel, zou de extra actieve HRas moleculen in elk ROI produceren extra fluorescentie pieken die bijgevolg zou opblazen kbind (Fig. 3k, rechter paneel en Supplementary Fig. S14). Inderdaad, we zagen een dergelijke bifasische trend van kbind voor de tumor weefsel, met een drempel bij ~ 3 HRas naar beneden getrokken per pm2 (Fig. 3l).
Dus, onder de drempel voor kbind inflatie, zou de waargenomen spike kinetiek grotendeels weerspiegelen de activiteit van enkele-HRas moleculen. Met name bij 1,6-1,9 HRas naar beneden getrokken per um2, werden soortgelijke kbind waarden van 0,28 s-1 en 0,22 s-1 waargenomen voor de tumor en controle weefsel-afgeleide HRas eiwitten, respectievelijk (Fig. 3l). De kdiss metingen waren ook zeer vergelijkbaar bij 2,5 s-1 (Supplementary Fig. S15). Het tumor-afgeleide enkel-oncogene HRas had bijgevolg een schijnbare dissociatieconstante van 180 nM, en dit was zeer vergelijkbaar met de 230 nM dissociatieconstante voor het actieve HRas uit controleweefselextract. Onze waarnemingen wijzen op een cruciaal feit dat de single-molecule activiteit van het oncogene HRas niet dramatisch verschilt van die van een geactiveerde wild-type HRas.
Wat onderscheidt dan deze kankerachtige toestand van de normale toestand? De drempel voor kbind-inflatie stelt ons in staat een andere belangrijke statistiek van celsignalerende eiwitten te kwantificeren, namelijk het aandeel van HRas-eiwitten die actief binden met cRafRBD. Intuïtief moet de drempel voor kbind inflatie overeenkomen met een specifieke oppervlaktedichtheid van ‘actieve’ lokaaseiwitten. In onze beeldvorming regeling, werd deze drempel gevonden te zijn op 0,6 actieve aas per um2, die niet afhankelijk is van de gedetailleerde soorten aas en prooi eiwitten (Supplementary Fig. S13). Aangezien de drempel voor kbind inflatie werd waargenomen op totaal 3 HRas naar beneden getrokken per um2, werd de fractie van actieve HRas direct geschat op ongeveer 20% voor de tumor weefsel. In tegenstelling, waren we niet in staat om kbind inflatie waar te nemen wanneer zelfs 25 HRas eiwitten werden neergehaald per um2 van het controleweefsel (Fig. 3l). Deze waarnemingen geven aan dat het oncogene HRas afkomstig uit tumorweefsel een hogere actieve fractie heeft dan het controle weefsel-afgeleide HRas met een orde van grootte.
We vroegen ons tenslotte af of dit hogere aandeel van actieve Ras een eenvoudig gevolg zou kunnen zijn van de HRas overexpressie in de xenografted tumor. De overgeëxpresseerde HRas eiwitten zouden het aantal mogelijke bindingspartners kunnen overtreffen, waardoor ze beschikbaar blijven voor binding aan eGFP-gelabelde Raf. Om deze vraag direct te beantwoorden, testten wij twee menselijke borstkanker cellijnen, MCF-7 die wild-type KRas heeft en MDA-MB-231 die een mutante vorm van KRas heeft (G13D; Fig. 4). Met name van de MDA-MB-231 cellen is bekend dat zij een oncogen verslaving aan het gemuteerde KRas gen vertonen en dat zij voor hun overleving kritisch afhankelijk zijn van een afwijkende KRas signalering26,27. Met behulp van deze twee cellijnen zijn wij ook in staat te bepalen of onze methoden van toepassing zijn op de KRas-signalering, die van cruciaal belang is voor de moleculaire diagnostiek en behandeling van vele vormen van kanker bij de mens28.
(a,b) Single-molecule western blot analyses van KRas expressieniveaus. eGFP-gelabeld KRas werd gebruikt als de probe Ras. Het expressieniveau van het wild-type KRas in de MCF-7-lijn bedroeg 17,3±1,3 nM, terwijl dat van het G13D-mutant KRas in de MDA-MB-231-lijn 5,5±0,3 nM per 1 mg ml-1 extract bedroeg. De foutbalkjes geven de s.d. aan (n=200). (c) kbind als functie van KRas pull down. Merk op dat dezelfde kbind waarde gedeeld door de wild-type en mutant KRas in de single-molecule kinetiek gebied (de gemeenschappelijke vlakke lijn). De drempel voor kbind werd gemeten op 1,2 naar beneden getrokken KRas per um2 voor de mutant KRas van MDA-MB-231, die een geschatte actieve fractie van 50% gaf. Deze waarde was een orde van grootte hoger dan 6% van de wild-type KRas van MCF-7, die de drempel had op 10 KRas naar beneden getrokken per pm2. Foutbalken geven s.e. (n>150).
We direct KRas getrokken van deze cel extracten met behulp van een KRas-specifiek primair antilichaam. Onze single-molecule western blot analyse toonde aan dat het wild-type KRas in MCF-7 cellen een hogere concentratie (17 nM) heeft dan het mutante KRas in MDA-MB-231 cellen (5,5 nM in 1 mg ml-1 extracten; Fig. 4a en Supplementary Fig. S16). Gezien de KRas oncogen verslaving van MDA-MB-231 cellen, was hun kleinere KRas expressie niveau een nogal onverwachte waarneming. Bovendien is de single-molecule signalering kinetiek voor de wild-type en mutant KRas zijn in wezen dezelfde (Fig. 4c, de gemeenschappelijke vlakke lijn; zie aanvullende Fig. S15 voor kdiss). Aan de andere kant, onze real-time single-molecule co-IP lost dat de drempel voor kbind inflatie voor de mutant KRas van MDA-MB-231 is geïdentificeerd op 1,2 KRas naar beneden getrokken per pm2, terwijl de drempel wordt waargenomen bij ~ 10 KRas naar beneden getrokken per pm2 voor de wild-type KRas van MCF-7 (Fig. 4c). Aangezien de kbind inflatie altijd optreedt bij 0,6 actieve baits per pm2, deze verschillende drempels direct aangeven dat de actieve fractie van de mutant KRas die sterk bindt aan zijn downstream doel (15 nM cRafRBD) is 50%, bijna een orde van grootte hoger dan 6% getoond door de wild-type KRas. De hogere actieve fractie van de oncogene mutant Ras is dus duidelijk geen overexpressie artefact, omdat de mutant KRas tot expressie kwam op lagere niveaus, maar een hogere actieve fractie vertoonde dan het wilde type.