Tiole reagują z tym związkiem, rozszczepiając wiązanie disiarczkowe, dając 2-nitro-5-tiobenzoesan (TNB-), który jonizuje się do dianionu TNB2- w wodzie w pH obojętnym i zasadowym. Ten jon TNB2- ma żółtą barwę.
Reakcja ta jest szybka i stechiometryczna, z dodaniem jednego mola tiolu uwalnia jeden mol TNB. TNB2- jest oznaczany ilościowo w spektrofotometrze poprzez pomiar absorbancji światła widzialnego przy długości fali 412 nm, przy zastosowaniu współczynnika ekstynkcji 14,150 M-1 cm-1 dla rozcieńczonych roztworów buforowych i współczynnika 13,700 M-1 cm-1 dla wysokich stężeń soli, takich jak 6 M chlorowodorek guanidyny lub 8 M mocznik. Niestety współczynnik ekstynkcji dla rozcieńczonych roztworów został niedoszacowany w oryginalnej publikacji z 1959 roku, jako 13,600 M-1 cm-1, i jak zauważono w ostatnim artykule, błąd ten utrzymał się w literaturze. Komercyjny DTNB może nie być całkowicie czysty, więc może wymagać rekrystalizacji, aby uzyskać całkowicie dokładne i powtarzalne wyniki.
Odczynnik Ellmana może być stosowany do pomiaru tioli o niskiej masie cząsteczkowej, takich jak glutation, zarówno w czystych roztworach, jak i próbkach biologicznych, takich jak krew. Może on również mierzyć liczbę grup tiolowych na białkach.
.