Thiolii reacționează cu acest compus, scindând legătura disulfură pentru a da 2-nitro-5-thiobenzoat (TNB-), care se ionizează la dianionul TNB2- în apă la pH neutru și alcalin. Acest ion TNB2- are o culoare galbenă.
Această reacție este rapidă și stoichiometrică, prin adăugarea unui mol de tiol eliberându-se un mol de TNB. TNB2- se cuantifică într-un spectrofotometru prin măsurarea absorbției luminii vizibile la 412 nm, folosind un coeficient de extincție de 14,150 M-1 cm-1 pentru soluții tampon diluate și un coeficient de 13,700 M-1 cm-1 pentru concentrații mari de sare, cum ar fi clorhidrat de guanidiniu 6 M sau uree 8 M. Din nefericire, coeficientul de extincție pentru soluțiile diluate a fost subestimat în publicația originală din 1959, ca fiind de 13.600 M-1 cm-1 și, după cum se menționează într-un articol recent, această greșeală a persistat în literatura de specialitate. Este posibil ca DTNB comercial să nu fie complet pur, astfel încât poate necesita recristalizare pentru a obține rezultate complet precise și reproductibile.
Reactivul lui Ellenman poate fi utilizat pentru măsurarea tiolilor cu masă moleculară mică, cum ar fi glutationul, atât în soluții pure, cât și în probe biologice, cum ar fi sângele. De asemenea, poate măsura numărul de grupări tiol de pe proteine.
.