Aksiaalinen resoluutio

1.43.2 The Case for Superresolution Microscopy Techniques

Lateraalinen ja aksiaalinen resoluutio valomikroskoopissa ovat pohjimmiltaan diffraktiorajoitteisia valon aallonpituuden ja kuvantamiseen käytettävän objektiivin aukon eli hyväksymiskulman välisessä suhteessa, kuten Ernst Abbe kuvasi vuonna 1873. Sivuttaisulottuvuudessa tämä erotuskyvyn raja on noin 200 nm ja aksiaalisessa ulottuvuudessa noin 500 nm. Optisen mikroskopian diffraktioraja johtuu kuvanmuodostuksessa käytettävän optiikan perustavanlaatuisista rajoituksista. Jos tarkastelemme aliresoluutioisen pallomaisen valonlähteen muodostamaa kuvaa, huomaamme, että edes täydellisesti korjatun, aberraatiovapaan mikroskooppioptiikan tuloksena syntyvää kuvaa ei kuvaa yksinkertainen pallo. Itse asiassa polttopisteessä havaitaan monimutkainen 3D-intensiteettijakauma, ja tätä 3D-intensiteettijakaumaa voidaan kuvata matemaattisesti pisteen hajontafunktiolla (PSF) (kuva 1). PSF:n keskimmäinen maksimi sisältää 86,5 % käytettävissä olevasta kokonaisenergian intensiteetistä. Sekä sivu- että aksiaaliulottuvuuksissa jäljelle jäävä energiaintensiteetti muodostuu sarjasta maksimeja ja minimejä kiertosymmetrisesti. Vierekkäisten kuvapiirteiden PSF:ien vuorovaikutus määrittää viime kädessä valomikroskoopin diffraktioresoluutiorajan.

Kuva 1. Valomikroskooppi. XY (a) ja XZ (b) intensiteettikartat ihanteellisesta pistehajontafunktiosta.

Kun kaksi kohdetta lähestyy toisiaan avaruudessa, niiden PSF:t menevät päällekkäin, eikä kahta kohdetta voida pian erottaa toisistaan. Kahden PSF:n pienimmän päällekkäisyyden, joka voidaan sietää ennen kuin kyky erottaa nämä kaksi toisistaan heikkenee, on kuvattu olevan piste, jossa intensiteetti laskee noin 25 % näiden kahden PSF:n välillä. Kohta, jossa tämä intensiteetin lasku saavutetaan, vastaa PSF:n keskimmäisen maksimin ja ensimmäisen minimin välistä etäisyyttä. Tämän etäisyyden tarkka määrittäminen on hyvin vaikeaa, koska minimiä on vaikea sijoittaa tarkasti, ja sen sijaan käytetään PSF:n keskimmäisen maksimin täyden leveyden puolimaksimia (FWHM, full-width half-maximum).

Kummastakin yhtälöstä nähdään, että lateraalinen ja aksiaalinen erottelukyky ovat riippuvaisia valoa keräävän optisen systeemin numeerisesta apertuurista ja valon aallonpituudesta. Parempi erotuskyky saadaan käyttämällä suuren numeerisen aukon objektiivilinssejä ja lyhyempiä valon aallonpituuksia. Muut tekijät, kuten kahden kohteen suhteellinen kirkkaus (kontrasti), vaikuttavat tähän pienimpään erotuskykyiseen etäisyyteen. Käytännössä mikroskooppikuvantamisessa tarvitaan sekä riittävä optinen numeerinen apertuuri että riittävä kontrasti, jotta voidaan tarkastella tarkasti osasolujen yksityiskohtia.

Valaistuksen aallonpituuden laskeminen ultraviolettialueelle resoluution parantamiseksi rajoittaa fluoresoivien koettimien valinnanvaraa ja asettaa optisten korjausten ja mikroskoopin optisen reitin läpäisyominaisuuksien rajat. Lisäkomplikaatioita aiheuttaa ultraviolettivalaistuksen käyttö elävien solujen tutkimuksissa, joissa monet tutkijat ovat havainneet näiden aallonpituuksien haitalliset vaikutukset solujen pitkäaikaiseen elinkelpoisuuteen. Nykyaikaiset optiset mallit ovat parantaneet linssien numeerisia aukkoja, mutta todellista parannusta tässä suhteessa on saatu aikaan vain käyttämällä eksoottisia kiinnitysmateriaaleja ja peitinlasimateriaaleja. Molemmilla strategioilla ei saada aikaan kuin vaatimaton parannus resoluutiossa, ja ne ovat epäkäytännöllisiä elävien solujen tutkimuksessa.

Biologisesta konfokaalimikroskopiasta, jossa käytetään reikäaukkoa parantamaan tarkennuksen sisäistä kontrastia poistamalla tehokkaasti hajavalo tarkennuksen ulkopuolisilta kohteen tasoilta, on tullut vakiokuvantamisväline solujen rakenne-toiminta-suhteiden tutkimuksessa. Tarkennetun kuvatason visualisoinnin parantaminen mahdollistaa sen, että resoluution käytännön diffraktiorajat saavutetaan helpommin, kun laitetta säädetään kriittisesti. Teoreettisesti alle yhden Airy-yksikön suuruisilla reikäaukoilla lateraalinen ja aksiaalinen resoluutio paranee itse asiassa 1,4-kertaiseksi laajakenttämikroskooppitapaukseen verrattuna. Käytännössä alle 1 Airy-yksikön läpimittaiset reiät tuottavat kuitenkin liian vähän valoa biologiseen kuvantamiseen, koska reikä hylkää suuren osan tarkennuksen sisällä olevasta emissiosta yhdessä ei-toivotun tarkennuksen ulkopuolisen valon kanssa. Biologisessa kuvantamisessa, jossa yleensä kamppaillaan päästösignaalin saamiseksi, on epäkäytännöllistä hylätä osa tästä rajallisesta signaalista pienen resoluutiolisäyksen vuoksi. Kun näytteestä tuleva emissiosignaali on rajallinen, neulanreikä avataan yleensä halkaisijaltaan suuremmaksi kuin 1 Airy-yksikkö, jotta saadaan kerättyä enemmän signaalia suuremman optisen viipaleen paksuuden kustannuksella. Näillä reikien halkaisijoilla konfokaalimikroskoopin resoluutio on olennaisesti sama kuin tavanomaisen laajakenttäfluoresenssimikroskoopin resoluutio.

Tämä ei tarkoita, etteikö resoluutiorajaa pienempiä kohteita voitaisi havaita – havaitseminen jopa yksittäisten molekyylien tasolla on mahdollista, ja nykyään se on suhteellisen suoraviivaista nykyaikaisten detektoritekniikoiden avulla. Objektiiviin tulevan suoran valaistuksen täydellinen poistaminen pimeäkenttämikroskopiassa luo erinomaisen kontrastin, joten jopa diffraktiorajoitteisten kohteiden, kuten mikrotubulusten (halkaisija 25 nm), sirontaan joutuvan valon pieni määrä on helppo havaita. Fluoresenssimikroskopia tarjoaa myös erinomaiset kontrastiolosuhteet, jotka mahdollistavat sellaisten kohteiden havainnoinnin ja tallentamisen, joiden mitat ovat selvästi alle diffraktiorajan. TIRF-fluoresenssimikroskopiassa (total internal reflection fluorescence microscopy) kontrasti paranee tavanomaiseen laajakenttäfluoresenssimikroskopiaan verrattuna rajoittamalla aksiaalinen heräte muutaman sadan nanometrin etäisyydelle nesteen ja lasin rajapinnasta käyttämällä fluoresenssiaineita herättävässä fluoresenssissa evanesenssista, lähikentän valoenergiaa. Näissä olosuhteissa jopa yhden molekyylin liikkuvuutta voidaan seurata ajan mittaan hyvin ohuessa optisessa osassa. Pimeäkenttämikroskopia tai TIRF-mikroskopia eivät kuitenkaan paranna optisen järjestelmän resoluutiota – molemmat tekniikat perustuvat suuriin kontrastieroihin kiinnostavan kohteen ja taustan välillä, jotta aliresoluution havaitseminen olisi mahdollista.

Klassisen diffraktioresoluutiorajauksen ohittaminen on ollut suuri haaste nykyaikaisessa valomikroskopiassa. Hyödyt, joita saadaan parantamalla kykyämme erottaa hienompia yksityiskohtia optisella mikroskoopilla, ovat ilmeisiä. Suurempi resoluutio mahdollistaisi tarkemman rakenteellisen kuvauksen molekyyliorganisaatioista, jotka ovat perustavanlaatuisia solujen normaalin ja epänormaalin fysiologian ja käyttäytymisen kannalta. Molekulaariset ja biokemialliset analyysit eivät riitä paljastamaan toiminnallisten organisaatioiden monimutkaisuutta, kuten esimerkiksi adheesiokeskuskontakteissa esiintyviä organisaatioita. Kyky visualisoida nämä toiminnalliset organisaatiot suoraan molekyyliulottuvuutta lähestyvällä resoluutiolla lisäisi huomattavasti ymmärrystämme molekyylien keskinäisistä suhteista ja organisaation muutoksista, jotka liittyvät toiminnallisiin tai fysiologisiin tiloihin. Viime aikoina useat tutkijat ovat hyödyntäneet useita erilaisia strategioita, joiden avulla he ovat pystyneet parantamaan huomattavasti (2- tai 10-kertaisesti tai paremmin) klassisia lateraalisen ja aksiaalisen resoluution rajoja. Nämä tekniikat jakautuvat kahteen yleiseen kategoriaan: tekniikat, jotka perustuvat näytteen valaistuksen muutoksiin, ja tekniikat, jotka käyttävät yksittäisten molekyylien havaitsemisstrategioita yhdessä aikaulottuvuuden kanssa superresolved-kuvauksen rakentamiseksi.

Tässä artikkelissa on valittu tekniikat, jotka ovat johtaneet useiden valmistajien kaupallisten instrumenttien kehittämiseen ja käyttöönottoon. Tämän erityisen kriteerin käyttämistä jäljempänä käsiteltävien menetelmien valinnassa ei missään tapauksessa pidä tulkita näiden tekniikoiden suosimiseksi muiden kirjallisuudessa esiteltyjen tekniikoiden kustannuksella. Kun työ tällä nopeasti muuttuvalla alalla kehittyy, saattaa olla, että uudet menetelmät ja lähestymistavat syrjäyttävät jäljempänä kuvatut menetelmät ja lähestymistavat. Näiden kaupallisten laitteiden tuominen markkinoille antaa kuitenkin monille eri tieteenalojen biologeille mahdollisuuden soveltaa superresoluutiomenetelmiä omiin erityisiin biologisiin kysymyksiinsä, mikä vie nämä menetelmät pois erikoistuneista kehityslaboratorioista. Lukijoita kannustetaan tutkimaan itse korkealaatuisia kuvia, jotka sisältyvät monien viitattujen artikkeleiden liitteenä olevaan verkkolisäaineistoon.