Axial upplösning

1.43.2 Argumentet för tekniker för superupplösande mikroskopi

Laterala och axiella upplösningar i ljusmikroskopet är i grund och botten diffraktionsbegränsade i förhållandet mellan ljusets våglängd och öppningen, eller acceptansvinkeln, för objektivlinsen som används för bildframställning, enligt Ernst Abbes beskrivning från 1873. I den laterala dimensionen är denna upplösningsgräns ungefär 200 nm och i den axiella dimensionen är gränsen ungefär 500 nm. Diffraktionsgränsen för optisk mikroskopi beror på de grundläggande begränsningarna i den optik som används för bildframställning. Om vi betraktar den bild som bildas av en sfärisk ljuskälla med lägre upplösning finner vi att den bild som uppstår även med perfekt korrigerad, aberrationsfri mikroskopoptik inte beskrivs av en enkel sfär. I själva verket observeras en komplex 3D-intensitetsfördelning vid brännpunkten, och denna 3D-intensitetsfördelning kan matematiskt beskrivas med hjälp av punktspridningsfunktionen (PSF) (figur 1). PSF:s centrala maximum innehåller 86,5 % av den totala tillgängliga energiintensiteten. I både laterala och axiella dimensioner kartläggs den återstående energiintensiteten i en serie maxima och minima på ett rotationssymmetriskt sätt. Det är samspelet mellan PSF:er från intilliggande bildelement som i slutändan bestämmer ljusmikroskopets diffraktionsupplösningsgräns.

Figur 1. XY (a) och XZ (b) intensitetskartor för en ideal punktspridningsfunktion.

När två objekt närmar sig varandra i rummet överlappar deras PSF:er varandra och snart kan de två objekten inte särskiljas från varandra. Den minsta överlappning av två PSF:er som kan tolereras innan man förlorar förmågan att skilja de två från varandra har beskrivits som den punkt där intensiteten sjunker med ungefär 25 % mellan de två PSF:erna. Den punkt där denna intensitetsminskning uppnås är likvärdig med avståndet mellan det centrala maximumet och det första minimumet i PSF. Det är mycket svårt att exakt bestämma detta avstånd eftersom det är svårt att placera minimumet exakt, och i stället används FWHM (full-width half-maximum) för PSF:s centrala maximum.

Från båda ekvationerna ser vi att de laterala och axiella upplösningarna är beroende av den numeriska aperturen hos det optiska system som samlar in ljuset och av ljusets våglängd. Förbättrad upplösningsförmåga fås genom att använda objektiv med hög numerisk apertur och kortare våglängder i ljuset. Andra faktorer som den relativa ljusstyrkan hos de två objekten (kontrast) påverkar detta minsta upplösbara avstånd. I praktiska termer, vid avbildning i mikroskop, är både tillräcklig optisk numerisk apertur och tillräcklig kontrast nödvändiga för att man exakt ska kunna se subcellulära detaljer.

Sänker man belysningsvåglängden till det ultravioletta området för att förbättra upplösningen, begränsar man sina val av fluorescerande prober och pressar gränserna för optiska korrigeringar och transmissionsegenskaperna hos mikroskopets optiska bana. Ytterligare komplikationer kommer från användningen av ultraviolett belysning i studier av levande celler där många forskare har noterat de skadliga effekterna av dessa våglängder på cellens långsiktiga livsduglighet. Modern optisk konstruktion har förbättrat objektivens numeriska aperturer, även om verkliga förbättringar i detta avseende endast har skett genom användning av exotiska monteringsmedier och täckglasmaterial. Båda dessa strategier misslyckas med att göra mer än en blygsam förbättring av upplösningen och är opraktiska för studier av levande celler.

Biologisk konfokalmikroskopi, som använder en hålöppning för att förbättra kontrasten i fokus genom effektivt avlägsnande av ströljusljus från objektplan som inte är fokuserade, har blivit ett standardverktyg för studier av cellulära struktur-funktionsrelationer. Den förbättrade visualiseringen av det fokuserade bildplanet gör det lättare att uppnå de praktiska diffraktionsgränserna för upplösningen när instrumentet är kritiskt justerat. Teoretiskt sett, med pinhålsöppningar på mindre än 1 Airy-enhet, förbättras faktiskt den laterala och axiella upplösningen till en gräns som är 1,4 gånger så hög som i fallet med ett bredfältsmikroskop. I praktiken ger dock håldiametrar på mindre än 1 Airy-enhet för lite ljus för biologisk avbildning, eftersom en stor del av det fokuserade ljuset avvisas av hålen tillsammans med det oönskade ofokuserade ljuset. För biologisk avbildning, där man vanligtvis kämpar för att få fram emissionssignalen, är det opraktiskt att förkasta en del av denna begränsade signal för en liten ökning av upplösningen. När emissionssignalen från provet är begränsad väljer man vanligtvis att öppna pinhålet till diametrar som är större än 1 Airy-enhet för att samla in mer signal på bekostnad av en större optisk skivtjocklek. Vid dessa stifthålsdiametrar är det konfokala mikroskopets upplösning i stort sett densamma som för ett konventionellt fluorescensmikroskop med brett fält.

Detta betyder inte att man inte kan detektera objekt som är mindre än upplösningsgränsen – detektering till och med på nivån för enstaka molekyler är möjlig, och numera relativt enkel med hjälp av modern detektorteknik. Det fullständiga borttagandet av den direkta belysningen som kommer in i objektivet vid mörkfältsmikroskopi skapar en utmärkt kontrast så att även den lilla mängd ljus som sprids av diffraktionsbegränsade objekt som mikrotubuli (25 nm i diameter) lätt kan observeras. Fluorescensmikroskopi ger också utmärkta kontrastförhållanden som gör det möjligt att observera och registrera objekt som har dimensioner långt under diffraktionsgränsen för upplösning. Med TIRF-mikroskopi (total internal reflection fluorescence) förbättras kontrasten jämfört med vanlig bredfältsfluorescensmikroskopi genom att begränsa den axiella excitationen till några hundra nanometer av gränssnittet mellan vätska och glas genom att använda den evanescenta ljusenergin från närfältet för excitering av fluoroforer. Under dessa förhållanden kan även rörligheten hos enstaka molekyler följas över tiden i ett mycket tunt optiskt snitt. Varken mörkfälts- eller TIRF-mikroskopi förbättrar dock det optiska systemets upplösning – båda teknikerna förlitar sig på stora kontrastskillnader mellan det intressanta objektet och bakgrunden för att möjliggöra detektering med lägre upplösning.

Att överskrida de klassiska diffraktionsupplösningsgränserna har utgjort en stor utmaning inom modern ljusmikroskopi. Fördelarna med att förbättra vår förmåga att lösa upp finare detaljer från det optiska mikroskopet är uppenbara. En högre upplösning skulle möjliggöra en mer exakt strukturell beskrivning av molekylära organisationer som är grundläggande för normal och onormal cellulär fysiologi och beteende. Molekylära och biokemiska dissektioner räcker inte långt när det gäller att avslöja komplexiteten i funktionella organisationer, t.ex. de som finns vid adhesionsfokuskontakter. Att direkt kunna visualisera dessa funktionella organisationer med upplösningar som närmar sig den molekylära dimensionen skulle avsevärt öka vår förståelse av molekylära inbördes relationer och förändringar i organisationen i samband med funktionella eller fysiologiska tillstånd. På senare tid har ett antal forskare utnyttjat flera olika strategier för att åstadkomma avsevärda (2- till 10-faldiga eller bättre) förbättringar av de klassiska laterala och axiella upplösningsgränserna . Dessa tekniker kan delas in i två allmänna kategorier: de som bygger på förändringar i belysningen av provet och de som använder strategier för detektion av enstaka molekyler tillsammans med tidsdimensionen för att bygga upp en superupplöst bild.

För denna artikel har man valt de tekniker som har lett till att flera tillverkare har utvecklat och introducerat kommersiella instrument. Att använda detta specifika kriterium för att välja de metoder som diskuteras nedan ska inte på något sätt tolkas som ett godkännande av dessa tekniker framför andra som har introducerats i litteraturen. I takt med att ytterligare arbete utvecklas på detta snabbt föränderliga område kan det hända att nya metoder och tillvägagångssätt tar över de metoder som beskrivs nedan. Genom att dessa kommersiella instrument introduceras på marknaden kan emellertid ett stort antal biologer från olika discipliner tillämpa superupplösningsmetoder på sina egna specifika biologiska frågeställningar, vilket gör att dessa metoder inte längre är avsedda för specialiserade utvecklingslaboratorier. Läsarna uppmanas att själva undersöka de högkvalitativa bilder som finns i det kompletterande material online som åtföljer många av de refererade artiklarna.