Tengelyes felbontás

1.43.2 A szuperfelbontású mikroszkópiai technikák esete

A fénymikroszkópok oldalsó és tengelyes felbontása alapvetően a fény hullámhossza és a képalkotáshoz használt objektív lencse apertúrája vagy befogadási szöge közötti viszonyban diffrakciósan korlátozott, amint azt Ernst Abbe 1873-ban leírta. Az oldalsó dimenzióban ez a felbontási határ körülbelül 200 nm, az axiális dimenzióban pedig körülbelül 500 nm. Az optikai mikroszkópia diffrakciós határa a képalkotáshoz használt optika alapvető korlátaiból ered. Ha a felbontás alatti gömb alakú fényforrás által alkotott képet tekintjük, azt találjuk, hogy a még tökéletesen korrigált, aberrációmentes mikroszkópoptikából származó képet nem írja le egy egyszerű gömb. Valójában a fókuszpontban egy összetett 3D intenzitáseloszlás figyelhető meg, és ez a 3D intenzitáseloszlás matematikailag leírható a pontterjedési függvénnyel (PSF) (1. ábra). A PSF központi maximuma a rendelkezésre álló teljes energiaintenzitás 86,5%-át tartalmazza. Mind az oldalirányú, mind az axiális dimenzióban a fennmaradó energiaintenzitás forgásszimmetrikusan szimmetrikusan maximumok és minimumok sorozatába rendeződik. A szomszédos képi jellemzőkből származó PSF-ek kölcsönhatása az, ami végső soron meghatározza a fénymikroszkóp diffrakciós felbontási határát.

1. ábra. XY (a) és XZ (b) intenzitástérképek egy ideális pontterjedési függvényről.

Amikor két objektum térben közeledik egymáshoz, PSF-jeik átfedik egymást, és hamarosan a két objektum nem különböztethető meg egymástól. A két PSF minimális átfedését, amely tolerálható, mielőtt a két objektum egymástól való megkülönböztethetőségének elvesztése bekövetkezne, úgy írták le, hogy az a pont, ahol az intenzitás körülbelül 25%-kal csökken a két PSF között. Az a pont, ahol ez az intenzitáscsökkenés bekövetkezik, megegyezik a PSF központi maximuma és első minimuma közötti távolsággal. Ezt a távolságot nagyon nehéz pontosan meghatározni, mivel a minimumot nehéz pontosan elhelyezni, ezért ehelyett a PSF központi maximumának teljes szélesség-félmaximumát (FWHM) használják.

A két egyenletből látható, hogy a laterális és axiális felbontás a fényt összegyűjtő optikai rendszer numerikus apertúrájától és magától a fény hullámhosszától függ. A jobb felbontóképesség a nagy numerikus apertúrájú objektívlencsék és a rövidebb hullámhosszúságú fény objektívlencsék használatával érhető el. Más tényezők, például a két objektum relatív fényereje (kontraszt) befolyásolják ezt a minimális felbontható távolságot. Gyakorlati szempontból a mikroszkópos képalkotásban mind a megfelelő optikai numerikus apertúra, mind a megfelelő kontraszt szükséges a szubcelluláris részletek pontos megtekintéséhez.

A megvilágítás hullámhosszának az ultraibolya tartományba való csökkentése a felbontás javítása érdekében korlátozza a fluoreszcens szondák választási lehetőségeit, és feszegeti az optikai korrekciók és a mikroszkóp optikai útjának transzmissziós tulajdonságainak határait. További bonyodalmakat okoz az ultraibolya megvilágítás használata élő sejtes vizsgálatokban, ahol számos kutató megjegyezte, hogy ezek a hullámhosszok káros hatással vannak a sejtek hosszú távú életképességére. A modern optikai konstrukciók javították a lencsék numerikus apertúráját, bár valódi javulás ebben a tekintetben csak az egzotikus hordozóanyagok és fedőüvegek használatával történt. Mindkét stratégia csak szerény mértékben javítja a felbontást, és az élő sejtek tanulmányozására nem alkalmas.

A biológiai konfokális mikroszkópia, amely tűlyuk-apertúrát használ a fókuszon belüli kontraszt javítására a fókuszon kívüli tárgysíkokból származó szórt fény hatékony eltávolítása révén, a sejtek szerkezetének és működésének összefüggéseit vizsgáló standard képalkotó eszközzé vált. A fókuszban lévő képsík megjelenítésének javítása lehetővé teszi, hogy a műszer kritikus beállításakor könnyebben elérjük a felbontás gyakorlati diffrakciós határait. Elméletileg 1 Airy-egységnél kisebb tűlyuk-apertúra esetén az oldalirányú és tengelyirányú felbontás ténylegesen a nagylátószögű mikroszkóp esetének 1,4-szeresére javul. A gyakorlatban azonban az 1 Airy-egységnél kisebb lyukátmérő túl kevés fényt biztosít a biológiai képalkotáshoz, mivel a fókuszon belüli emisszió nagy részét a lyuk a nem kívánt fókuszon kívüli fénnyel együtt visszautasítja. Biológiai képalkotás esetén, ahol általában az emissziós jel megszerzéséért küzdenek, e korlátozott jel egy részének visszautasítása a felbontás kis mértékű növelése érdekében nem praktikus. Valójában, amikor a minta emissziós jele korlátozott, általában úgy döntünk, hogy a tűlyukat 1 Airy-egységnél nagyobb átmérőjűre nyitjuk, hogy több jelet gyűjtsünk a nagyobb optikai szeletvastagság árán. Ilyen lyukátmérőknél a konfokális mikroszkóp felbontása lényegében megegyezik a hagyományos, széles látómezejű fluoreszcens mikroszkópéval.

Ez nem jelenti azt, hogy nem lehet a felbontási határnál kisebb objektumokat detektálni – a detektálás még az egyetlen molekula szintjén is lehetséges, és ma már viszonylag egyszerű a modern detektortechnológiák segítségével. Az objektívbe belépő közvetlen megvilágítás teljes eltávolítása a sötétmező-mikroszkópiában kiváló kontrasztot hoz létre, így még az olyan, diffrakciós korlátos objektumok, mint a mikrotubulusok (25 nm átmérőjű) által szórt kis mennyiségű fény is könnyen megfigyelhető. A fluoreszcencia-mikroszkópia szintén kiváló kontrasztfeltételeket biztosít, amelyek lehetővé teszik olyan objektumok megfigyelését és rögzítését is, amelyek mérete jóval a diffrakciós felbontási határ alatt van. A teljes belső visszaverődéses fluoreszcencia (TIRF) mikroszkópiával a kontraszt javul a standard nagymezős fluoreszcencia-mikroszkópiához képest azáltal, hogy az axiális gerjesztést a folyadék-üveg határfelület néhány száz nanométerére korlátozzák azáltal, hogy a fluorofór gerjesztésére az evaneszcens, közeli mezőben lévő fényenergiát használják. Ilyen körülmények között akár egyetlen molekula mobilitása is nyomon követhető időben egy nagyon vékony optikai szelvényen belül. Azonban sem a sötétmezős, sem a TIRF-mikroszkópia nem javítja az optikai rendszer felbontását – mindkét technika az érdeklődésre számot tartó objektum és a háttér közötti nagy kontrasztkülönbségre támaszkodik, hogy lehetővé tegye az alulfelbontású detektálást.

A klasszikus diffrakciós felbontási határok átlépése nagy kihívást jelentett a modern fénymikroszkópiában. Az optikai mikroszkópból származó finomabb részleteket felbontó képességünk javításából származó előnyök nyilvánvalóak. A nagyobb felbontás lehetővé tenné a normális és abnormális sejtfiziológia és viselkedés szempontjából alapvető molekuláris szervezetek pontosabb szerkezeti leírását. A molekuláris és biokémiai boncolások csak korlátozottan képesek feltárni az olyan funkcionális szervezetek komplexitását, mint amilyenek az adhéziós fókuszkontaktusokban találhatók. Ha képesek lennénk közvetlenül, a molekuláris dimenziót megközelítő felbontással megjeleníteni ezeket a funkcionális szervezeteket, az jelentősen növelné a molekuláris összefüggések és a szervezetben a funkcionális vagy fiziológiai állapotokhoz kapcsolódó változások megértését. A közelmúltban számos kutató számos különböző stratégiát használt ki a klasszikus oldalirányú és tengelyirányú felbontási korlátok jelentős (2-szeres-tízszeres vagy jobb) javítására . Ezek a technikák két általános kategóriába sorolhatók: azok, amelyek a minta megvilágításának változásaira támaszkodnak, és azok, amelyek az egymolekulás detektálási stratégiákat az idődimenzióval együtt használják a szuperfelbontott kép felépítéséhez.

Ez a cikk azokat a technikákat választotta, amelyek több gyártó által kifejlesztett és bevezetett kereskedelmi műszerekhez vezettek. Az alábbiakban tárgyalt módszerek kiválasztásakor e konkrét kritérium alkalmazása semmiképpen sem értelmezhető úgy, hogy ezeknek a technikáknak a támogatását jelentené az irodalomban bemutatott más technikákkal szemben. Ahogy a további munka fejlődik ezen a gyorsan változó területen, előfordulhat, hogy új módszerek és megközelítések előzik meg az alább leírtakat. Ezeknek a kereskedelmi műszereknek a piacra kerülése azonban lehetővé teszi, hogy a különböző tudományágak biológusainak széles köre alkalmazhassa a szuperfelbontási módszereket saját konkrét biológiai kérdéseire, kivonva ezeket a módszereket a speciális fejlesztő laboratóriumokból. Az olvasókat arra ösztönözzük, hogy saját maguk is vizsgálják meg a számos hivatkozott cikket kísérő online kiegészítő anyagban található kiváló minőségű képeket.