Rezoluția axială

1.43.2 Cazul tehnicilor de microscopie de superrezoluție

Rezolutările laterale și axiale la microscopul de lumină sunt în mod fundamental limitate de difracție în relația dintre lungimea de undă a luminii și deschiderea, sau unghiul de acceptare, a obiectivului folosit pentru imagistică, așa cum a fost descris de Ernst Abbe în 1873. În dimensiunea laterală, această limită de rezoluție este de aproximativ 200 nm, iar în dimensiunea axială, limita este de aproximativ 500 nm. Limita de difracție a microscopiei optice provine din limitările fundamentale ale opticii utilizate în formarea imaginii. Dacă luăm în considerare imaginea formată de o sursă sferică de lumină cu rezoluție redusă, constatăm că imaginea care rezultă chiar și din optica microscopului perfect corectată și fără aberații nu este descrisă de o sferă simplă. De fapt, se observă o distribuție complexă de intensitate 3D în punctul focal, iar această distribuție de intensitate 3D poate fi descrisă matematic prin funcția de răspândire a punctului (PSF) (figura 1). Maximul central al PSF conține 86,5% din intensitatea energetică totală disponibilă. Atât în dimensiunea laterală, cât și în cea axială, intensitatea energetică rămasă este cartografiată într-o serie de maxime și minime într-un mod simetric din punct de vedere rotațional. Interacțiunea PSF-urilor din elementele adiacente ale imaginii este cea care determină în cele din urmă limita de rezoluție prin difracție a microscopului optic.

Figura 1. Hărți de intensitate XY (a) și XZ (b) ale unei funcții de împrăștiere a punctelor ideale.

Când două obiecte se apropie unul de celălalt în spațiu, PSF-urile lor se suprapun și, în curând, cele două obiecte nu pot fi discriminate unul de celălalt. Suprapunerea minimă a două PSF-uri care poate fi tolerată înainte de pierderea capacității de a le distinge unul de celălalt a fost descrisă ca fiind punctul în care intensitatea scade cu aproximativ 25% între cele două PSF-uri. Punctul în care este atinsă această scădere de intensitate este echivalent cu distanța dintre maximul central și primul minim al PSF. Este foarte dificil de determinat cu exactitate această distanță, deoarece este dificil de poziționat cu precizie minimul și, în schimb, se folosește jumătatea lățimii lățimii depline (FWHM) a maximului central al PSF.

Din ambele ecuații, vedem că rezoluțiile laterale și axiale depind de deschiderea numerică a sistemului optic care colectează lumina și de lungimea de undă a luminii în sine. Puterea de rezoluție îmbunătățită provine din utilizarea obiectivelor cu diafragmă numerică mare și a unor lungimi de undă mai scurte ale luminii. Alți factori, cum ar fi luminozitatea relativă a celor două obiecte (contrast), influențează această distanță minimă rezolvabilă. În termeni practici, în imagistica la microscop, sunt necesare atât o deschidere numerică optică suficientă, cât și un contrast suficient pentru a vizualiza cu acuratețe detaliile subcelulare.

Diminuarea lungimii de undă de iluminare în domeniul ultraviolet pentru a îmbunătăți rezoluția limitează opțiunile proprii de sonde fluorescente și împinge limitele corecțiilor optice și proprietățile de transmisie ale traseului optic al microscopului. Alte complicații provin din utilizarea iluminării cu ultraviolete în studiile pe celule vii, unde mulți cercetători au observat efectele dăunătoare ale acestor lungimi de undă asupra viabilității celulelor pe termen lung. Proiectele optice moderne au îmbunătățit deschiderile numerice ale lentilelor, deși îmbunătățirile reale în această privință au fost obținute doar prin utilizarea unor medii de montaj și a unor materiale exotice pentru sticlă de acoperire. Ambele strategii nu reușesc să aducă mai mult decât o îmbunătățire modestă a rezoluției și vin cu prețul de a fi nepractice pentru studiile pe celule vii.

Microscopia confocală biologică, care utilizează o deschidere cu orificiu de tip „pinhole” pentru a îmbunătăți contrastul în focalizare prin îndepărtarea efectivă a luminii rătăcite din planurile obiectului în afara focalizării, a devenit un instrument standard de imagistică în studiul relațiilor structură-funcție celulară . Îmbunătățirea vizualizării planului de imagine focalizat permite atingerea cu mai multă ușurință a limitelor practice de difracție ale rezoluției atunci când instrumentul este reglat în mod critic. Teoretic, cu deschideri ale orificiului stenopatic mai mici de 1 unitate Airy, rezoluțiile laterale și axiale se îmbunătățesc de fapt până la o limită de 1,4 ori mai mare decât cea din cazul microscopului cu câmp larg. Cu toate acestea, în practică, diametrele orificiilor de stenopii mai mici de 1 unitate Airy furnizează prea puțină lumină pentru imagistica biologică, deoarece o mare parte din emisia focalizată este respinsă de orificiul de stenopii împreună cu lumina nedorită din afara focalizării. În cazul imagisticii biologice, în care, de obicei, se luptă pentru a obține semnalul de emisie, respingerea unei părți din acest semnal limitat pentru un mic câștig de rezoluție nu este practică. De fapt, atunci când semnalul de emisie al probei este limitat, se alege, de obicei, să se deschidă orificiul de stenopa la diametre mai mari de 1 unitate Airy pentru a colecta mai mult semnal în detrimentul unei grosimi mai mari a feliei optice. La aceste diametre ale orificiului stenopatic, rezoluția microscopului confocal este, în esență, aceeași cu cea a unui microscop fluorescent convențional cu câmp larg.

Aceasta nu înseamnă că nu se pot detecta obiecte care sunt mai mici decât limita de rezoluție – detecția chiar și la nivelul unei singure molecule este posibilă și, în prezent, relativ simplă, folosind tehnologiile moderne de detecție. Eliminarea completă a iluminării directe care intră în obiectiv în microscopia în câmp întunecat creează un contrast excelent, astfel încât chiar și cantitatea mică de lumină împrăștiată de obiectele limitate de difracție, cum ar fi microtubulii (25 nm diametru), este ușor de observat. Microscopia cu fluorescență oferă, de asemenea, condiții excelente de contrast care pot permite observarea și înregistrarea obiectelor care au dimensiuni mult sub limita de difracție a rezoluției. În cazul microscopiei de fluorescență cu reflexie internă totală (TIRF), contrastul este îmbunătățit față de microscopia de fluorescență standard cu câmp larg prin limitarea excitației axiale la câteva sute de nanometri de la interfața fluid-copertă de sticlă, prin utilizarea energiei luminoase evanescente, de câmp apropiat, pentru excitarea fluoroforilor. În aceste condiții, chiar și mobilitatea unei singure molecule poate fi urmărită în timp în cadrul unei secțiuni optice foarte subțiri. Cu toate acestea, nici microscopia în câmp întunecat, nici microscopia TIRF nu îmbunătățesc rezoluția sistemului optic – ambele tehnici se bazează pe diferențe mari de contrast între obiectul de interes și fundal pentru a permite detecția la subrezoluție.

Depășirea limitelor clasice ale rezoluției de difracție a reprezentat o mare provocare în microscopia modernă de lumină. Beneficiile aduse de îmbunătățirea capacității noastre de a rezolva detalii mai fine la microscopul optic sunt evidente. O rezoluție mai mare ar permite o descriere structurală mai precisă a organizațiilor moleculare fundamentale pentru fiziologia și comportamentul celular normal și anormal. Disecțiile moleculare și biochimice nu ajung decât până la un anumit punct în dezvăluirea complexității organizațiilor funcționale, cum ar fi cele întâlnite la contactele focale de adeziune. Faptul de a putea vizualiza direct, cu rezoluții care se apropie de dimensiunea moleculară, aceste organizații funcționale ar spori în mod substanțial înțelegerea noastră a interrelațiilor moleculare și a modificărilor de organizare legate de stările funcționale sau fiziologice. Recent, o serie de cercetători au exploatat mai multe strategii diferite pentru a oferi îmbunătățiri substanțiale (de 2 până la 10 ori sau mai bine) ale limitelor clasice de rezoluție laterală și axială . Aceste tehnici se împart în două categorii generale: cele care se bazează pe modificări ale iluminării specimenului și cele care utilizează strategii de detecție cu o singură moleculă împreună cu dimensiunea temporală pentru a construi o imagine suprarezolvată.

În scopul acestui articol, au fost alese tehnicile care au condus la dezvoltarea și introducerea de instrumente comerciale de către mai mulți producători. Utilizarea acestui criteriu specific în selectarea metodelor discutate mai jos nu trebuie interpretată în niciun caz ca o aprobare a acestor tehnici în detrimentul altora care au fost introduse în literatura de specialitate. Pe măsură ce se dezvoltă în continuare lucrările în acest domeniu în schimbare rapidă, este posibil ca noi metode și abordări să le depășească pe cele descrise mai jos. Cu toate acestea, introducerea pe piață a acestor instrumente comerciale permite unei game largi de biologi din diferite discipline să aplice metodele de superrezoluție la propriile întrebări biologice specifice, scoțând aceste metode din laboratoarele de dezvoltare specializate. Cititorii sunt încurajați să investigheze singuri imaginile de înaltă calitate conținute în materialul suplimentar online care însoțește multe dintre articolele la care se face referire.

.