チオールはこの化合物と反応してジスルフィド結合を切断し、2-ニトロ-5-チオベンゾエート（TNB-）を与え、中性およびアルカリ性のpHでは水中でTNB2-ジニオンにイオン化する。 このTNB2-イオンは黄色をしています。
DTNBとチオール（R-SH）の反応
この反応は速く、化学量論的に、チオール1モルの添加によりTNB1モルを放出させる反応であると言えます。 TNB2-は分光光度計で412nmの可視光の吸光度を測定し、希薄な緩衝液では14,150 M-1 cm-1、6Mグアニジニウム塩酸塩や8M尿素などの高濃度の塩では13,700 M-1 cm-1の消衰係数で定量される。 残念ながら、1959年の原著では希薄溶液の消衰係数が13,600 M-1 cm-1と過小評価されており、最近の論文にもあるように、この間違いは文献上も残っているようである。
Ellman’s reagentは、純粋な溶液でも血液などの生体試料でも、グルタチオンのような低分子チオールの測定に用いることができる。 また、タンパク質上のチオール基の数を測定することも可能です
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