Zwierzęta
C57BL/6J animals were purchased from Jackson Laboratory, Slac Laboratory Animal (Shanghai) and bred in house. Esr1-2a-Cre (Esr1Cre, #017913) i Vglut2-Ires-Cre (Vglut2Cre, #012569) zostały zakupione z Laboratorium Jacksona. Linia Vgat-Cre (VgatCre) została wcześniej wygenerowana68. Wszystkie linie Cre były hodowane na tle C57BL/6J przez co najmniej jedno pokolenie. Zwierzęta były trzymane w zakładzie dla zwierząt Institute of Neuroscience w cyklu światło/ciemność 12 h:12 h z jedzeniem i wodą ad libitum. W badaniach stosowano wyłącznie zwierzęta heterozygotyczne dla alleli Cre. Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Animal Care and Use Committee of the Institute of Neuroscience, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China (IACUC No. NA-016-2016).
Surgery
Dorosłe myszy w wieku 2-4 miesięcy znieczulono izofluranem (0,8-5%) i umieszczono w ramie stereotaktycznej (David Kopf Instrument, Model 1900). Zastosowano maść okulistyczną, aby zapobiec odwodnieniu. Czaszka została odsłonięta przez małe nacięcie i wywiercono otwory do wstrzyknięcia wirusa za pomocą szklanych pipet (o średnicy 15-25 μm na końcu) i do wszczepienia włókien optycznych. Współrzędne podawania wirusa do mPOA wynosiły AP, -0,16 mm; ML, ±0,4 mm; DV, -5,150 mm (atlas mózgu myszy Paxios i Franklin, wydanie 2). 100-400 nl wirusa wstrzykiwano na stronę z szybkością przepływu 70 nl na minutę za pomocą domowej roboty nanolitrowego wstrzykiwacza lub z szybkością 40 nl na minutę za pomocą pompy hydraulicznej (Harvard Apparatus). Szklane pipety pozostawiano na miejscu przez około ~10 minut po wstrzyknięciu, a następnie wycofywano. Światłowody monooptyczne (średnica, 200 μm; N.A., 0,37; długość, 6 mm; AniLab Software and Instruments Co., Ltd) lub podwójne światłowody optyczne (DFC_200/245-0,37_6,0mm_DF0,9_FLT; Doric Lense) umieszczano 400 μm powyżej miejsca wstrzyknięcia wirusa dla eksperymentów optogenetycznych lub 50 μm powyżej dla zapisów fotometrii światłowodowej. Włókna optyczne zostały zabezpieczone cementem dentystycznym i śrubami czaszkowymi. Kolegów z miotu wybierano losowo do wstrzyknięcia eksperymentalnego lub kontrolnego wirusa. Zabiegi kastracji przeprowadzono u zwierząt znieczulonych dootrzewnowym (i.p.) wstrzyknięciem ketaminy (80 mg kg-1) i ksylazyny (8 mg kg-1). Zwierzęta miały 3-4 tygodnie na dojście do siebie po operacjach przed kolejnymi testami behawioralnymi.
Wirusy
Atesty behawioralne
Wszystkie testy behawioralne rozpoczynano co najmniej pół godziny po rozpoczęciu cyklu ciemności i rejestrowano za pomocą kamery na podczerwień z częstotliwością odświeżania 25 Hz, a oceny dokonywali eksperymentatorzy zaślepieni na genotyp, informacje o grupie lub status fotostymulacji zwierząt biorących udział w badaniu. Wszystkie zwierzęta badane pod kątem zachowań, z wyjątkiem tych wykorzystywanych w eksperymentach z hamowaniem optogenetycznym, były przed badaniem naiwnymi myszami dziewiczymi. W doświadczeniach z inhibicją optogenetyczną, wszystkie samce myszy były trzymane z samicami, a niektóre z nich zostały ojcami przed badaniem, podczas gdy niektóre samice były trzymane ze szczeniętami, lub kryte, aby stać się matkami, lub traktowane tygodniowymi zastrzykami testosteronu przed badaniem. Z wyjątkiem zwierząt używanych w eksperymentach aktywacji optogenetycznej, wszystkie zwierzęta były trzymane pojedynczo 3-7 dni przed testami behawioralnymi.
Do testów zachowań godowych, hormonalnie primed ovariectomized C57BL/6 samica została wprowadzona do klatki domowej i videotaping przez 30 min. Testy zachowań godowych powtarzano trzykrotnie z różnymi zwierzętami bodźcowymi w odstępie co najmniej trzech dni. Zachowania rodzicielskie testowano poprzez rozrzucenie trzech szczeniąt w wieku od P1 do P4 na obrzeżach gniazda i nagrywanie ich przez około 15 minut. Testy powtarzano 2-3 razy. Agresję terytorialną testowano wprowadzając mysz intruza rasy Balb/c zakupioną od Slac Laboratory Animal (Szanghaj) do klatki domowej badanego zwierzęcia i nagrywając wideo przez ~15 min.
Wideo było ręcznie opisywane klatka po klatce za pomocą specjalnie napisanego programu MATLAB, jak opisano wcześniej8. Zachowania były punktowane według następujących kryteriów: kontakty nos-twarz, nos-ciało lub nos-urogenitalne inicjowane przez badane zwierzęta są punktowane zbiorczo jako „badanie społeczne”, z których kontakt nos-urogenitalny jest specyficznie definiowany jako „badanie chemiczne”, znane również jako „wąchanie”. „Montowanie” jest punktowane, gdy zwierzę doświadczalne umieszcza kończyny przednie na grzbiecie bodźca, wspina się na niego i porusza miednicą. Rytmiczne ruchy miednicy po zamocowaniu są punktowane jako „pchnięcie miednicą”. Działania zainicjowane przez rezydenta w kierunku samca intruza, w tym wypady, ugryzienia, przewracanie się, są punktowane jako „Atak”. „Kontakt ze szczenięciem” jest punktowany, gdy zwierzę dotknęło szczeniaka nosem lub pyskiem. „Odzyskanie szczenięcia” jest punktowane, gdy zwierzę trzyma szczenię pyskiem i wędruje, zwykle w kierunku gniazda. „Przykucnięcie” jest punktowane, gdy zwierzę wygina grzbiet w łuk i unosi się nad szczeniętami w gnieździe. Szczenięta były zawsze sprawdzane po próbie behawioralnej pod kątem ewentualnych ran. Około 2% prób behawioralnych zakończyło się zranieniem szczeniąt. Wykluczenie tych prób nie miało wpływu na żadne wnioski.
Aktywacja optogenetyczna
Zwierzęta używane do eksperymentów optogenetycznych były trzymane w grupach. W dniu testu behawioralnego wprowadzano je do świeżej klatki. Zewnętrzny światłowód był używany do podłączenia źródła mocy lasera 473 nm (Shanghai Laser and Optics Century Co. lub Changchun New Industries Optoelectronics Tech Co., Ltd.) do implantowanego światłowodu w zwierzęciu. Zewnętrzny światłowód był przymocowany do przegubu obrotowego (FRJ_1 × 1_FC_FC, Doric Lense), aby umożliwić zwierzęciu swobodne zachowanie. Badane zwierzę mogło eksplorować klatkę przez ~15 min z podłączonym światłowodem zewnętrznym. Następnie uruchamiano niestandardowy program MATLAB do sterowania urządzeniem Master 9 (A.M.P.I.), które wysyłało wyzwalacz inicjujący zapis z kamery oraz sygnały do lasera w celu dostarczenia 15 s fotostymulacji o częstotliwości 40 Hz 12 mW lub 20 Hz 5 mW, rozmieszczonych w losowych odstępach 90-120 s. Moc lasera była regulowana dla każdego zwierzęcia zgodnie z wydajnością transkryptu luminancji wszczepionego światłowodu, mierzoną przed implantacją, aby zapewnić moc światła emitowanego na końcu światłowodu. Podczas stymulacji laserowej zwierzęta były badane albo same pod kątem lokomocji, albo z hormonalnie primed ovariectomizowaną samicą, samcem C57BL/6, młodym szczurem w wieku P13-P15, szczeniętami w wieku P1-P4, lub gumowymi blokami o podobnej wielkości szczeniąt jako bodźcem. Podczas każdego badania podawano od pięciu do dwunastu bodźców. W danym dniu u każdego zwierzęcia wykonywano po jednej-czterech prób z każdym bodźcem (w odstępie 3-5 min). Po zakończeniu wszystkich testów behawioralnych, zwierzętom podawano serie fotostymulacji (15 s, 12 mW, 40 Hz, 10 razy, stała przerwa 105 s) i perfundowano przezskórnie 4% paraformaldehydem godzinę po stymulacji świetlnej do analizy histologicznej. Krew pobierano również w czasie uśmiercania do pomiarów hormonalnych.
Fotometria włókien
Zwierzęta używane do eksperymentów fotometrii włókien były trzymane w odosobnieniu 3-7 dni przed testami behawioralnymi. W dniu badania, wszczepiony światłowód był podłączony do F-scope (Biolink Optics Technology Inc., Pekin), zintegrowanego zestawu do rejestracji fotometrii światłowodowej, poprzez zewnętrzny światłowód. W F-scope, laser wzbudzający o długości fali 488 nm (OBIS 488LS; Coherent) jest odbijany od lustra dichroicznego (MD498, Thorlabs). Sygnały emisyjne zbierane przez implantowany światłowód są filtrowane za pomocą filtra pasmowego (MF525-39, Thorlabs) i kierowane na lampę fotopowielającą (PMT, R3896, Hamamatsu). Podczas nagrań, moc lasera była regulowana dla każdego zwierzęcia zgodnie z wydajnością przejścia luminancji wszczepionego światłowodu, aby zapewnić, że światło emitowane na końcu światłowodu wynosiło ~30 μw, a wzmocnienie napięcia PMT było ustawione na 500 v dla zwierząt GCamp6s i 300-350 v dla zwierząt kontrolnych. Po uruchomieniu, oprogramowanie F-scope wysyłało sygnał wyzwalający, aby zainicjować rejestrację wideo z kamery na podczerwień. Sygnały emisyjne były filtrowane dolnoprzepustowo przy 30 Hz i próbkowane z częstotliwością 500 Hz za pomocą karty akwizycji danych (USB6009, National Instrument) przy użyciu oprogramowania dostarczonego przez Biolink Optics. Dla danej próby, zwierzętom pozwalano najpierw na eksplorację przez ~5 min, w tym czasie rejestrowano sygnały bazowe. Następnie wprowadzano bodziec, taki jak hormonalnie primed ovariectomizowana samica, sztuczna plastikowa zabawka dla myszy, szczenięta w wieku P1-P4 lub gumowe klocki podobnej wielkości jak szczenięta. Zwierzętom pozwalano na interakcję i zachowanie z bodźcami przez 15-90 min przed usunięciem bodźców, po czym sygnały rejestrowano przez kolejne ~5 min.
Inhibicja optogenetyczna
Zwierzęta używane do eksperymentów z inhibicją optogenetyczną były trzymane w pojedynczych pomieszczeniach. Samce myszy były trzymane w jednym pomieszczeniu z samicami, które miały być doświadczone seksualnie lub stać się ojcami przed badaniem. Dziewice myszy były testowane jako naiwne zwierzęta do samca-typowe krycia i dla zachowań macierzyńskich. W przypadku słabych podstawowych zachowań macierzyńskich podczas wstępnego testu, były one trzymane ze szczeniętami przez noc i ponownie testowane pod kątem zachowań macierzyńskich. Po testach zachowań macierzyńskich, niektóre samice były traktowane co drugi dzień podskórnymi iniekcjami testosteronu (100 μg w 50 μl oleju słonecznikowego, Shanghai Pharm.) przez około 3 tygodnie przed ponownym testem na krycie typowe dla samców. Samice testowane jako matki były kojarzone po wstrzyknięciu wirusa, aby wyprodukować własne szczenięta.
Przed testem behawioralnym, podwójny światłowód patch cord (DFP_200/230/900-0.37_1m_DF0.9_2FCM, Doric Lense) został użyty do podłączenia źródła mocy lasera 473 nm (Shanghai Laser and Optics Century Co. lub Changchun New Industries Optoelectronics Tech Co, Ltd.) do wszczepionego podwójnego włókna optycznego (DFC_200/245-0,37_6,0mm_DF0,9_FLT, Doric Lense) u zwierzęcia poprzez złącze obrotowe (FRJ 1 × 2i FC-2FC 0,22, Doric Lense), aby umożliwić zwierzęciu swobodne zachowanie. Po ~10 minutach przebywania, kamera była wyzwalana w celu zarejestrowania procesu behawioralnego przez sygnał wysłany z Master 9, który był kontrolowany przez specjalnie napisany program MATLAB. Aby dostarczyć światło po zbliżeniu, światło (~12 mW) było automatycznie wyzwalane do ciągłego dostarczania tak długo, jak długo pozycje badanych zwierząt były wykrywane przez program, aby znajdować się w odległości jednej długości ciała do hormonalnie primed ovariectomizowanej samicy w testach zachowań godowych lub w regionie szczeniąt, który został zdefiniowany przez zaznaczenie nieco większego obszaru otaczającego każde rozproszone szczenię w testach zachowań macierzyńskich. Przynajmniej dwie próby z oświetleniem i dwie próby bez światła były wykonywane naprzemiennie dla każdego testu. Aby dostarczyć światło po zainicjowaniu określonych zachowań, niebieskie światło (~12 mW) o stałej długości (5 lub 10 s) było uruchamiane ręcznie, gdy eksperymentator obserwował interesujące go zachowanie w czasie rzeczywistym. Jedna lub dwie próby świetlne były wykonywane alternatywnie dla każdego testu.
Barwienie fluorescencyjne
Zwierzęta były znieczulane 10% wodzianem chloralu i perfundowane przezskórnie PBS, a następnie zimnym jak lód 4% paraformaldehydem (PFA) w PBS. Następnie dokonywano sekcji mózgów o grubości 40 μm za pomocą wibratomu (VT1000S, Leica). Sekcje były dzielone równo na kilka zestawów i przetwarzane do barwienia lub montowane bezpośrednio. Sekcje mózgowe blokowano w 5% surowicy koziej w AT (0,1% Triton i 2 mM MgCl2 w PBS) przez 1 h w temperaturze pokojowej i inkubowano przez noc w 4 °C w AGT (0,5% normalnej surowicy koziej, 0.1% Triton i 2 mM MgCl2 w PBS) zawierającym odpowiednie przeciwciało pierwotne (królicze anty-c-Fos, 1:2000, Santa Cruz, Cat# sc-52; królicze anty-Esr154, 1:10,000, Millipore, Cat# 06-935). Następnego dnia skrawki mózgu płukano trzykrotnie AGT (po 30 min) i inkubowano z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi (Alexa Fluor 488 skoniugowany, 1:1000; Cy3 skoniugowany, 1:1000, Jackson ImmunoResearch) w temperaturze pokojowej przez 2 h. Skrawki mózgu barwiono Neuro Trace (Life Technologies, Cat# N21479, 1:300) lub DAPI (5 mg ml-1, 1:1000, Sigma) w AT. Po kilkukrotnym płukaniu w AGT, AT i PBS, sekcje mózgów montowano na szklanych szkiełkach.
Barwienie DAB
Sekcje mózgów przygotowywano podobnie do eksperymentów z barwieniem fluorescencyjnym i poddawano wstępnej obróbce 3% H2O2 przez 30 min w temperaturze pokojowej w celu zablokowania endogennej peroksydazy, płukano dwukrotnie po 10 min w PBST (0.3% Triton X-100 w PBS), blokowano 5% surowicą kozią w PBST przez 2 h w temperaturze pokojowej i inkubowano z pierwotnym przeciwciałem anty-c-Fos (Rabbit anti-c-fos, 1:2000, Santa Cruz, Cat# sc-52) w PBST przez noc w 4 °C. Następnego dnia sekcje płukano sześciokrotnie w PBST, po 10 min każda, a następnie inkubowano z przeciwciałem drugorzędowym kozim anty-rabbitem sprzężonym z biotyną (Cat#111-065-003, Jackson ImmunoResearch) w PBST przez 2 h w temperaturze pokojowej. Po trzech płukaniach w PBS, po 5 min każde, sekcje mózgu były barwione VECTASTAIN® ABC Reagent przez 30 min zgodnie z instrukcją producenta. Po dwóch 5-minutowych płukaniach w PBS, skrawki mózgu były inkubowane w roztworze 3,3-diaminobenzydyny (Cat# D5637-5G, Sigma) z intensyfikacją niklową, aż do osiągnięcia pożądanej intensywności barwienia. Reakcja została zatrzymana przez płukanie sekcji w wodzie z kranu. Sekcje mózgu montowano na szklanych szkiełkach i rejestrowano pod obiektywami ×4 lub ×10 przy użyciu konwencjonalnych mikroskopów świetlnych.
Hybrydyzacja in situ
Szablony DNA do generowania sond in situ klonowano przy użyciu następujących zestawów primerów dla każdego odpowiadającego genu: Vgat, 5′-gccattcaggcatgttc-3′ i 5′-agcagcgtgaagaccacc-3′; Vglut2, 5′-atcgactagtccaaatcttacgtgctacctc-3′ i 5′-atcgctcgagtagccatctcctcctgttccact-3′; Cre, 5′- ccaatttactgaccgtacca-3′ i 5′-tatttacattgtccagccacc-3′; GAD1, 5′-cattgaggagatagaggttg-3′ i 5′-agagaagcgaaggctact-3′; Galanina, 5′-atcctgcactgaccagcc-3′ i 5′-ttggctgagttgggc-3′. Sondy antysensownego RNA były transkrybowane przy użyciu polimerazy T7 RNA (Promega, Cat# P207E) i nukleotydów znakowanych digoksigeniną (DIG). Zwierzęta znieczulano 10% wodzianem chloralu i perfundowano przezskórnie PBS nasyconym DEPC (D-PBS), a następnie zimnym 4% paraformaldehydem (PFA) w D-PBS. Następnie dokonywano sekcji mózgów o grubości 40 μm za pomocą wibratomu (VT1000S, Leica). Sekcje mózgu płukano w buforze 2XSSC zawierającym 0,1% tryton przez 30 min, acetylowano w 0,1 M trietanoloaminie (pH 8,0) z 0,25% bezwodnikiem octowym (vol/vol) przez 10 min, wyrównano w roztworze do wstępnej hybrydyzacji przez 2 h w temperaturze 65 ℃, a następnie inkubowano z 0,5 μg ml-1 specyficznych sond RNA w buforze hybrydyzacyjnym przez noc w temperaturze 65 ℃. Następnego dnia, sekcje płukano w roztworze do wstępnej hybrydyzacji i pre-hyb/TBST (TBS z 0,1% tween-20) przez 30 min każdy. Następnie sekcje płukano dwukrotnie roztworem TBST i trzykrotnie TAE, każde po 5 min. Wycinki przenoszono do studzienek w 2% żelu agarozowym, które poddawano działaniu 1XTAE pod napięciem 60 V przez 2 h w celu usunięcia niezhybrydyzowanych sond. Sekcje płukano dwukrotnie w TBST, a następnie inkubowano z owczym przeciwciałem antydigoksygenin-AP (1:2000, Roche, Cat# 11093274910), czasami razem z króliczym przeciwciałem anty-Esr1 (1:3000, Millipore, Cat# 06-935) w celu współbarwienia, w 0,5% odczynniku blokującym (Roche, 11096176001) w temperaturze 4°C przez noc. Drugiego dnia, w celu barwienia w jasnym polu, sekcje płukano i barwiono NBT (Roche, Cat# 11383213001) i BCIP (Roche, Cat# 11383221001) przez 4-10 h w temperaturze 37 ℃. W przypadku fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ połączonej z immunohistochemią, sekcje barwiono najpierw fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi, a następnie barwiono szybką czerwienią (HNPP Fluorescent Detection Set, Roche, Cat# 11758888001) i przeciwbarwiono DAPI (5 mg ml-1, 1:1000, Sigma) w PBS. Wszystkie sekcje zostały wypłukane po barwieniu i zamontowane na szklanych szkiełkach. Obrazy były rejestrowane z obiektywem ×20 przy użyciu mikroskopu konwencjonalnego lub konfokalnego.
catFISH
Większość zwierząt użytych w eksperymencie catFish była doświadczona. W ramach procedury, zwierzętom umożliwiono dwa 5-minutowe epizody interakcji społecznych z hormonalnie primed ovariectomizowaną samicą lub rozproszonymi szczeniętami, w odstępie 30 min. Natychmiast po drugim epizodzie zwierzęta znieczulano 10% wodzianem chloralu i perfundowano przezskórnie DEPC-PBS, a następnie lodowato zimnym 4% PFA w PBS. Mózgi były wypreparowywane i utrwalane przez noc w temperaturze 4°C oraz odwadniane 30% sacharozą w DPEC-PBS. Następnie mózgi poddawano sekcji o grubości 20 μm i montowano na szkiełkach SuperFrost Plus® Slides (Fisher Scientific, nr kat. 12-550-15). Po wysuszeniu na powietrzu, szkiełka przechowywano w -80 °C przed obróbką zgodnie z RNAscope® Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 User Manual (ACD Bio.). Sondy przeciwko intronowi c-Fos, c-Fos mRNA i Esr1 zostały zamówione w ACD Bio. i użyte w eksperymencie. Obrazy były rejestrowane pod obiektywem ×60 przy użyciu mikroskopu konfokalnego.
Zapisy elektrofizjologiczne
Zwierzęta C57BL/6, którym wstrzyknięto AAV kodujące ChR2-mCherry w mPOA lub myszy Esr1Cre, którym wstrzyknięto AAV kodujące GtACR1, znieczulono izofluranem i perfundowano przezskórnie lodowato zimnym natlenionym (95% O2/5% CO2) roztworem wysokosacharozy (skład w mM: 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 2 Na2HPO4, 2 MgSO4, 213 sacharoza, 26 NaHCO3). Po wypreparowaniu mózgu, sekcje koronalne obejmujące mPOA były cięte na 250 μm przy użyciu wibratomu (VT-1200S, Leica) w lodowatym, natlenionym roztworze tnącym. Następnie plastry mózgu inkubowano w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (ACSF; skład w mM: 126 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1,25 Na2HPO4, 2 MgSO4, 10 glukozy, 26 NaHCO3, 2 CaCl2) w temperaturze 34 °C przez co najmniej 1 h i rejestrowano w temperaturze pokojowej. Komórki identyfikowano pod mikroskopem fluorescencyjnym i wizualizowano za pomocą podczerwonego różnicowego kontrastu interferencyjnego (BX51, Olympus). Całokomórkowe rejestracje prądowe wykonywano za pomocą wzmacniacza MultiClamp700B i interfejsu Digidata 1440A (Molecular Devices). Elektrodę patch-clamp (5-8 MΩ) wypełniano roztworem wewnątrzkomórkowym (skład w mM: 120 K-glukonian, 4 KCl, 10 HEPES, 10 fosfokrytyna sodowa, 4 Mg-ATP, i 0,3 Na3-GTP, pH:7,3, 265 mOsm). W celu aktywacji optogenetycznej, niebieskie światło (473 nm, szerokość 10 ms, 14 mw mm-2, 40 impulsów) było dostarczane na plasterki przez obiektyw ×40 przy użyciu źródła światła X-Cite LED (Lumen Dynamics). Wierność spajków w neuronach wykazujących ekspresję ChR2 mierzono, licząc liczbę impulsów światła, które skutecznie wywoływały potencjały czynnościowe o różnych częstotliwościach. Wierność spajków była uśredniana dla pięciu stymulacji i wykreślana. W przypadku inhibicji optogenetycznej, potencjał czynnościowy neuronów GtACR1-ekspresyjnych indukowano przez wstrzymanie potencjału membranowego -48 mW za pomocą zastrzyku prądowego i powtarzanego ciągłego światła niebieskiego dostarczano na plastry.
Obrazowanie wapnia w plastrach mózgu
AAVs kodujące ChR2 i AAVs kodujące GCamp6s, oba napędzane przez hSyn, zostały wstrzyknięte do mPOA zwierząt C57BL/6. Ostre skrawki mózgu, w tym mPOA, przygotowywano w sposób podobny do opisanych powyżej procedur elektrofizjologicznych. Obrazowanie wapnia przeprowadzono przy użyciu laserowego mikroskopu skaningowego z dwoma fotonami (Ultima, Prairie Instruments Inc.) z obiektywem 20X/0.95-NA XLUMPLFL z wodną imersją (Olympus). Laser Ti:sapphire był dostrojony do 940 nm, a obrazy o rozmiarze 512 × 512 pikseli były pozyskiwane przez filtr emisyjny 525/70 nm z częstotliwością odświeżania 1,2 Hz. Randomizowane ciągi światła 470 nm (impuls 10-ms, 15 s, 8,4 mW mm-2) o różnych częstotliwościach (10 Hz, 20 Hz, 40 Hz) dostarczano do plasterków w odstępach ~2 min. Obrazy analizowano przy użyciu ImageJ.
Atesty hormonalne
Krew tułowia pobierano w czasie zabijania przed perfuzją. Przygotowano surowicę. Miano hormonów oznaczono przy użyciu zestawu ELISA testosteronu (DRG Instruments GmbH, Niemcy, Division of ARG international, Inc, Cat# EIA-1559) zgodnie z protokołami producenta.
Analiza danych
Wszystkie kody zostały napisane w MATLAB i użyte do analizy danych, i są dostępne na życzenie. Nie przeprowadzono obliczeń wielkości próbki. Liczba komórek zarejestrowanych w wycinku lub policzonych w barwieniu oraz liczba zwierząt użytych do testów behawioralnych i barwienia zostały wybrane zgodnie z opublikowaną literaturą podobnych eksperymentów. Punkty danych pochodzące od zwierząt, które po analizie histologicznej post hoc zostały uznane za błędnie trafione zgodnie z wcześniej ustalonymi kryteriami, zostały wyłączone z analizy. W sumie trzy samice myszy Esr1Cre i jeden samiec myszy Esr1Cre wstrzyknięty z GtACR1, jeden samiec i samica VgatCre oraz jedna samica myszy Esr1Cre wstrzyknięta z Casp3 zostały wykluczone z analizy.
Aby przeanalizować dane z eksperymentów obrazowania Ca2+ w plastrach mózgu, obrazy zostały skwantyfikowane w ImageJ. W skrócie, komórki GCaMP6s+ obrysowano ręcznie, a względne zmiany fluorescencji (ΔF/F) obliczono dla każdej komórki za pomocą równania ΔF/F = (F-F0)/F0, w którym F0 jest średnią intensywnością pikseli w ostatnich 10 klatkach przed fotostymulacją, a F jest średnią intensywnością pikseli w pierwszych 6 klatkach po fotostymulacji. Obrazy uzyskane podczas okresów fotostymulacji zostały wyłączone z analizy. Aktywowana komórka była operacyjnie definiowana jako komórki wykazujące wzrost ΔF/F, który był o 5 standardowych odchyleń od średnich wartości ΔF/F mierzonych w 30 klatkach przed pierwszą fotostymulacją.
Aby przeanalizować wywołaną światłem lokomocję, ślady ruchu były najpierw ekstrahowane przy użyciu niestandardowych kodów MATLAB, które rozpoznawały centroid zwierzęcia. Prędkość ruchu została następnie obliczona w 1 s binach czasowych poprzez pomiar przebytej odległości. 15 punktów danych prędkości ruchu w okresie fotostymulacji porównywano z poprzednimi 15 punktami, aby sprawdzić, czy stymulacja świetlna wywołała wzrost prędkości w danej próbie. Na poziomie zwierząt, średnie prędkości ruchu podczas każdego okresu fotostymulacji porównywano ze średnimi prędkościami ruchu bezpośrednio przed każdym okresem fotostymulacji, aby określić, czy lokomocja indukowana światłem zwiększa się u danego zwierzęcia. W przypadku indukowanego optogenetycznie montażu i pobierania szczeniąt, filmy wideo były najpierw oceniane ślepo. Dzienniki wideo zostały następnie dopasowane do dzienników fotostymulacji, aby wyodrębnić procentowy udział prób, opóźnienie początku i całkowity czas trwania wywołanych zachowań. Tylko zachowania, które wystąpiły podczas stymulacji świetlnej były liczone jako zachowania wywołane optogenetycznie. Jeśli jakieś zachowanie wystąpiło przed okresem fotostymulacji, ale mimo to przebiegało w tym okresie, nie było liczone jako zachowanie wywołane optogenetycznie. Parametry były zawsze uśredniane dla okresów fotostymulacji w tej samej próbie behawioralnej, a następnie dla wszystkich prób, jeśli było ich wiele. Aby wykreślić rozkład czasowy zachowań wywołanych optogenetycznie, do uśrednienia użyto tylko okresów fotostymulacji, w których wystąpiły zachowania. W próbach behawioralnych z samcem, młodym szczurem lub sztucznymi szczeniętami jako bodźcem lub gdy zwierzęta ChR2 były kastrowane, zachowania wywołane optogenetycznie porównywano z zachowaniami spontanicznymi, które wystąpiły w 15 s okresie bezpośrednio poprzedzającym okresy fotostymulacji.
Aby przeanalizować wpływ hamowania optogenetycznego na określone zachowania, filmy wideo były najpierw oceniane ślepo. Dzienniki wideo zostały następnie wyrównane do dzienników fotostymulacji, aby wyodrębnić zdarzenia behawioralne, które napotkały stymulację świetlną. Aby wykreślić różne parametry specyficznych zachowań, zdarzenia behawioralne, które napotkały bodziec świetlny, były uśredniane na poziomie próby, jeśli istniało wiele prób, a następnie na poziomie zwierzęcia. Aby wykreślić dystrybucję akumulacji określonych zachowań, analizowano tylko zdarzenia behawioralne, które napotkały stymulację świetlną.
Aby symulować centrum aktywacji dla zwierzęcia ChR2, obszar 1100×1500 μm z jedną stroną blisko linii środkowej i prostopadłą stroną blisko dna mózgu został wykadrowany z każdego koronalnego przekroju mózgu i został zmniejszony do 1 μm na piksel. Sygnały c-Fos w każdym 100×100 μm zostały wyodrębnione półautomatycznie przy użyciu programu MATLAB wraz z ImageJ i zsumowane w macierz 11 × 15 zgodnie z ich lokalizacją w każdym przekroju. Średnia liczba komórek NeuN/HuCD+ w obrębie kwadratu 100 μm2 została oszacowana na ~25. Aby obliczyć współrzędne centrum aktywacji wzdłuż osi boczno-przyśrodkowej i grzbietowo-wewnętrznej, liczby w macierzy 11 × 15 zostały uśrednione dla serii sekcji mózgu, które obejmowały przednią i tylną część dla każdego zwierzęcia i dopasowane za pomocą dwuwymiarowej funkcji gaussowskiej w MATLAB. Aby obliczyć przednio-tylną współrzędną centrum aktywacji, całkowita liczba c-Fos została zsumowana dla każdej sekcji mózgu i dopasowana za pomocą pojedynczej funkcji gaussowskiej.
Dla eksperymentów fotometrii włókien, surowe sygnały fluorescencji zostały dodatkowo dostosowane zgodnie z ogólnym trendem, aby uwzględnić fotowybielanie. Próby z rozstrojeniem, falami kwadratowymi sygnałów lub z ekstremalnie niskim stosunkiem sygnału do szumu zostały wykluczone z dalszej analizy. Dla początkowej odpowiedzi, wartości zmiany fluorescencji (ΔF/F) uzyskano przez obliczenie (F-F0)/F0, gdzie F0 jest medianą sygnału fluorescencji linii podstawowej. Dla sygnałów fluorescencji dopasowanych do zachowań, dane zostały podzielone na segmenty w oparciu o zdarzenia behawioralne w ramach poszczególnych prób, a średnie sygnały na 10-15 s przed inicjacją zachowania zostały użyte jako F0. Do analizy statystycznej istotności dwóch sygnałów fluorescencyjnych związanych ze zdarzeniem użyto testu t z FDR (false discovery rate) równym 0,05. Aby skorelować transjenty Ca2+ i zachowania, liczono narastające zdarzenie Ca2+, gdy wartości ΔF/F wynosiły 3 odchylenia standardowe powyżej wartości wyjściowej i trwały dłużej niż 2 s. Liczbę zdarzeń Ca2+ liczono pomiędzy pierwszym a ostatnim zachowaniem i korelowano z liczbą zdarzeń behawioralnych w tym okresie. Tylko próby behawioralne, które miały więcej niż dwa mocowania i więcej niż jedno pobieranie, zostały wykorzystane do analizy korelacji.
Obrazy histologiczne zostały uchwycone z obiektywem ×20 na mikroskopie konfokalnym, chyba że określono inaczej. Obrazy zostały przetworzone i policzone w ImageJ z kodami MATLAB napisanymi na zamówienie. Wszystkie liczenia zostały wykonane przez eksperymentatorów ślepych na płeć lub stan testowy zwierzęcia. Aby przeanalizować wirusową ekspresję ChR2, ręcznie zliczano współznakowanie ChR2, c-Fos i Nissl w centralnym obszarze wstrzyknięcia. Aby przeanalizować współznakowanie Esr1 i Vglut2, Vgat lub Galanin, pięć względnie stałych obszarów w pięciu sekcjach mózgu o podobnych pozycjach zostało wybranych do ręcznego liczenia. Aby sprawdzić specyficzność ekspresji Cre u zwierząt Esr1-cre, liczono ręcznie co-labeling Esr1 i Cre w różnych obszarach wielu plasterków uzyskanych od jednego zwierzęcia. Aby ocenić ilościowo obrazy z eksperymentów catFISH, które zostały wykonane pod obiektywem ×60, komórki pozytywne dla cytoplazmatycznego lub jądrowego c-Fos i dla Esr1 zostały rozpoznane z DAPI jako przeciwbarwieniem i policzone ręcznie. W celu ilościowego określenia efektów wirusowej ablacji neuronów Esr1+, sygnały Esr1+ w mPOA, jak zdefiniowano w Allen Brain Atlas, zostały policzone dla obu stron przy użyciu bezstronnej stereologii z oprogramowaniem Stereo Investigator (MBF bBioscience). Konkretnie, używając optycznej sondy frakcjonatora, sygnały Esr1+ były liczone w polu zliczania 30×30 μm w siatce próbkowania 100×100 μm. W celu ilościowego określenia efektów wirusowej ablacji neuronów Vgat+ lub Vglut2+, sekcje mózgu obrazowano z obiektywem ×10 przez Olympus VS120. Obszary barwiące się sygnałami Vgat+ lub Vglut2+ w mPOA i regionach przyległych zostały wyodrębnione półautomatycznie przy użyciu kodów MATLAB.
Statystyki
Dla wykresów słupkowych, dane są przedstawione jako średnia ± s.e.m. W wykresach pudełkowych i wąskowych, dane są przedstawione jako min do max wąsków i średnia wskazana przez „+” i mediana wskazana przez linię poziomą. Jeśli nie zaznaczono inaczej, przeprowadzono następujące testy statystyczne, a wszystkie testy określono jako dwustronne. Dane kategoryczne analizowano za pomocą dokładnego testu Fishera. Dane sparowane analizowano za pomocą testu par. Do analizy statystycznej różnicy rozkładu kumulacji zastosowano test dwusamplowy Kołmogorowa-Smirnowa. Dane z jedną zmienną niezależną analizowano za pomocą jednoczynnikowej ANOVA, a następnie testu post hoc z korektą Bonferroniego. Dane z dwiema zmiennymi niezależnymi analizowano za pomocą dwukierunkowej ANOVA, a następnie testu post hoc z korektą Bonferroniego. W przypadku pozostałych porównań, dane testowano pod kątem rozkładu testem normalności Lillieforsa. Jeśli dane przeszły test normalności, stosowano test parametryczny (test t-Studenta). W pozostałych przypadkach stosowano nieparametryczny test sumy rang Wilcoxona. Wartość p oraz współczynnik korelacji dla korelacji Pearsona obliczono stosując rozkład t-Studenta dla transformacji korelacji. *p < 0,05, **p ≤ 0,01, ***p < 0,001.
Dostępność danych
Wszystkie dane w tym badaniu są dostępne na żądanie.
.