Thioler reagerar med denna förening och klyver disulfidbindningen för att ge 2-nitro-5-thiobensoat (TNB-), som joniseras till TNB2-dianjonen i vatten vid neutralt och alkaliskt pH. Denna TNB2-jon har en gul färg.
Denna reaktion är snabb och stökiometrisk, där tillsatsen av ett mol tiol frigör ett mol TNB. TNB2- kvantifieras i en spektrofotometer genom att mäta absorbansen av synligt ljus vid 412 nm, med en extinktionskoefficient på 14 150 M-1 cm-1 för utspädda buffertlösningar och en koefficient på 13 700 M-1 cm-1 för höga saltkoncentrationer, t.ex. 6 M guanidiniumhydroklorid eller 8 M urea. Tyvärr underskattades extinktionskoefficienten för utspädda lösningar i den ursprungliga publikationen från 1959, som 13 600 M-1 cm-1, och som noterats i en nyligen publicerad artikel har detta misstag kvarstått i litteraturen. Kommersiell DTNB är kanske inte helt ren, så det kan krävas omkristallisering för att få helt exakta och reproducerbara resultat.
Ellmans reagens kan användas för att mäta tioler med låg molekylär massa, t.ex. glutation, i både rena lösningar och biologiska prover, t.ex. blod. Det kan också mäta antalet tiolgrupper på proteiner.